人工生殖技術：牛胚移置

EMBRYO TRANSFER OF COWS

推 廣 場 所：
台灣省畜產試驗所家畜生理系
台南縣新化鎮牧場 112 號
電話：(06)5911211
傳真：(06)5911210
聯 絡 人 ： 許登造先生　李世昌先生

牛胚移置是什麼？

　　牛胚移置是應用人工技術來收集親代牛隻配子（精子與卵子）結合後的新生命--牛胚，再移置於另一個具有滋養牛胚發育成胎之代孕母牛腹中，達成產下仔牛目的方式。

牛胚移置的用途：

  1. 可將具有優良性能之母牛進行超級排卵再配優良性能之公牛精液，藉非外科洗胚和胚移置之技術，來生產較多的優良後代。
  2. 可將年輕供胚牛的胚移置至懷孕能力佳的受胚牛體內生產仔牛，如此可縮短選種的世代間隔。
  3. 利用胚移置技術，使那些由於疾病、受傷或老化至不孕的女牛或母牛，也能生產後代。
  4. 可配合胚操縱技術，進行胚分割、胚融合、胚核轉置、外源基因注入、或性別鑑定以提高經濟效益。
  5. 牛胚可以冷凍方式半永久保存於液態氮中，以利牛之種原保存，且可將剩餘的新鮮胚凍保存待有同期化之受胚牛時再解凍移置，或進行國內各酪農及國際間的品種交流。
  6. 避免疾病傳染。胚於體外數次清洗後，可去除附於透明帶上的細菌，如再經胰蛋白   (Trypsin) 處理，則可去除附著於透明帶之病毒。

牛胚採集、冷凍及移置流程圖

非外科牛胚採集、移置或冷凍所需器材：

一、發情同期化及超級排卵：
  1. 2 ml 或 5 ml 注射筒（連針）；
  2. 酒精棉 (70 ％)；
  3. 發情同期化用藥前列腺素 prostaglandin F2α (PGF2α) 商品名預安得 (Estrumate)；
  4. 超級排卵用藥激濾泡素 (Follicular stimulating hormone； FSH) 或孕馬血清 (PMSG)；
二、人工授精：
  1. 人工授精器一組；
  2. 人工授精器保護套；
  3. 直腸固定用手套；
  4. 恆溫水瓶 （冷凍精液解凍用）；
  5. 冷凍精液；
  6. 子宮頸擴張棒；
三、非外科洗胚：
  1. 10ml、120ml、50ml注射筒；
  2. 21 號注射針；
  3. 70％ 酒精；
  4. 優碘及 250 ml 噴霧瓶；
  5. 70 ％ 酒精棉；
  6. 清潔劑；
  7. 紙巾；
  8. 盤尼西林；
  9. 子宮頸擴張棒；
  10. 1000ml 量筒（滅菌處理過）；
  11. 恆溫水槽；
  12. IMV三叉式洗胚器 (Three-way catheter with extensible head for embryo collection)；
  13. 2％ 普魯卡因 (Procaine)；
  14. 剪刀；
  15. 潤滑劑 (K~Y)；
  16. 洗胚管塑膠護套；
  17. 子宮灌注器；
  18. 直腸固定用手套；
  19. 滅菌之胚沖洗液 (mPBS)；

IMV三叉式洗胚器
四、胚尋取：
  1. 立體顯微鏡 (10~40×)；
  2. 直徑 10 cm 之培養皿四個；
  3. 直徑 3 cm 之培養皿十個；
  4. 滅菌之吸胚針；
  5. 滅菌之 dPBS 培養液；
五、冷凍處理：
  1. 0.25 ml 麥管；
  2. 簡易冷凍設備一套（含冷卻室支架、數位溫 度計及溫度測定針、液氮筒口固定架、麥管放置架、充氣幫浦、95％ 酒精、橡皮管）；
  3. 5 ％ glycerol／18％ FCS／dPBS；
  4. 10 ％ glycerol／18％ FCS／dPBS；
  5. 1 M Sucrose；
  6. 18 ％ FCS／dPBS；
  7. 封口粉；
  8. 液氮及液氮筒；
  9. 鑷子；
六、胚移置：
  1. IMV 胚移置注入器一套（含塑膠推棒、可深入子宮角內之金屬頭塑膠軟管）；
  2. 2 ％ 普魯卡因；
  3. 10 ml 注射筒連針；
  4. 酒精 (70 ％)；
  5. 優碘；
  6. 70 ％ 酒精棉；
  7. 剪刀；
  8. 潤滑劑 (K-Y)；
  9. 胚注入器塑膠保護套；
  10. 直腸固定用手套；
  11. 子宮頸擴張棒；
  12. 紙巾；
  13. 清潔劑；

IMV 胚移置注入器

牛胚移置操作過程：

一、發情同情化與超級排卵：

1.發情同情化：

　　使用前列腺素 (Estrumate) 處理一群牛， 使其能夠達 到同期發情及排卵為主要目的。處理方法有二：

  1. 有發情記錄之一群母牛，可利用發情週期在第 6天到第 16天內之母牛肌肉注射 2ml Estrumate 。或者以直腸觸診卵巢上是否有黃體，有黃體者肌注 2ml Estrumate ，如此經前列腺素處理後約 48∼96小時（ 平均 72小時），呈現發情現象（容許駕乘）。
  2. 無須觀察母牛的發情週期也不用直腸觸診卵巢是否有黃體，將準備處理的一群母牛進行二次前列腺素注射，同樣也 可達到發情同期化的目的。其方法是在第一次肌注前列腺素 (2 ml Estrumate) 一次，經過 11天再肌注前列腺素 ( 2ml Estrumate) 一次，經處理之母牛大部分可在第二次肌注前列腺素後 48∼96小時內偵測出發情。

2.超級排卵：

牛超級排卵、同期化處理方法

一、供胚牛超級排卵處理：

二、供胚牛超級排卵及受胚牛同期化處理：



備 註：

  1. 開始進行超級排卵之時間，是在牛的發情週期第八至十四天之間任選一天均可，上例是假設在發情週期第十天開始。

　　進行超級排卵的荷爾蒙藥劑有孕馬血清激性腺素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin；PMSG)和激濾泡素(Follicular stimulting hormone；FSH)兩種，其法如下：

(1)使用 PMSG 時：在發情週期的第 9∼12天任何一天肌注一次全劑量約
     2000∼3000 IU 的 PMSG，經 2∼3天再應用 前列腺素 PGF2α（約 2ml
     Estrumate）處理，經 48小時後可偵測出發情並予以配種。
(2)使用 FSH 時：在發情週情的第 9∼12天任何一天開始肌注 FSH，連續肌
     注 4∼5天每天兩次每次間隔 12小時，於結束前第二天第一劑注射時，同時給
     予前列腺素 PGF2α（約 2ml Estrumate）處理，經 48小時後可偵測出發
     情並予以配種。

二、人工授精：

　　因供胚牛受到超級排卵處理的影響，從開始排第一個卵到最後一個卵的排出需要一段時間，所以必需考慮人工授精的次數及精液使用量的增加。通常經超級排卵處理的供胚牛於人 工授精時需 2∼4次，每次間隔 12小時，每次精液用量約 1∼2支冷凍精液。

三、非外科洗胚：

　　牛隻配種後第 5天以後胚胎才進入子宮內，而應用非外科洗胚的方法僅能沖洗出在子宮內的胚胎，另外使用囊胚期的胚胎來進行冷凍其效果也較其他胚期為佳，基於此種種理由，進行非外科洗胚的最佳時間應於配種後的第 7∼8天。非外科洗胚的方法及步驟如下：

1.直腸觸診黃體數目：

先將供胚牛領入固定架內，固定架的地板前方需比後方高約 20公分（可用木板架高），使供胚牛站立時 前高後低。此時技術人員可將一隻手伸入直腸內，觸診卵巢的大小並估算黃體和濾泡的數目。
2.麻醉及消毒：

用剪刀把供胚牛尾根背部上的毛剪掉，再用 70％的酒精棉消毒，然後以硬膜外注射 6∼8ml 的 2％ 普魯卡因麻醉劑，接著將外陰部附近全部用清潔劑清洗並用 70％酒精和優碘噴霧消毒完成後，再將牛尾巴綁住不致妨害洗胚。

　

硬膜外麻醉

外陰部清潔

3.非外科沖洗胚：

　　將已準備好的洗胚導管前端塗上 K~Y 潤滑劑再套上塑膠保護套並於前端塗上 K~Y 潤滑劑後，助手將陰唇分開，使技術人員把洗胚導管伸入陰道，通至子宮頸管時，將洗胚導管外層塑膠保護套往後拉，使洗胚導管繼續通過子宮頸，塑膠保護套仍在子宮頸外。當進入子宮體時，調整到選擇的左邊或右邊子宮角上，洗胚導管的氣球正好位於兩邊子宮角分叉位置上，使用 20ml的注射筒打入10∼15ml的空氣使氣球膨脹，正好卡緊子宮襞防止沖洗液從氣球與子宮襞之間隙漏出來。接著將洗胚導管末端卡筍打開，使其沖洗液回收管容易往子宮角深部推送，至適當位置後再鎖緊以防止沖洗液直接從回收管外側流出。使用 50ml 注射筒抽取置於恆溫水槽（約 37℃ ）經滅菌處理過分裝在玻璃 瓶內之沖洗液，每次抽出50ml，並將沖洗液灌注入子宮內，同時注意沖洗液是否從回收管內流出至 1000ml 經滅菌處理過之量筒內，如此操作重覆五次，直到回收的沖洗液不再流出為止，然後慢慢地將回收導管移至另一邊子宮角上準備繼續沖洗，沖洗的方法同上。經由兩邊子宮角沖洗出的沖洗液約 500ml 左右， 收集在 1000ml 的量筒內，於室溫靜置待胚沈降下來。

沖洗胚

1000ml 的量筒

四、胚的收取及處理：
  1. 在室溫下將裝有回收之沖洗液量筒靜置約 30 分鐘後，用虹吸管將上層的回收沖洗液虹吸至另一空的燒杯內，僅留下底層約 100ml 左右，輕輕晃動後再倒入分裝 10cm培養皿之中，於立體顯微鏡下收取胚。
  2. 將尋到的胚，以滅菌過的毛細管吸至另一培養皿中清洗十次以上，然後再將每個胚分裝於 0.25ml的麥管中，供新鮮胚移置之用。新鮮胚的包裝方法如下圖所示。

虹吸上層的回收沖洗液　

分裝

　胚的收取

五、胚冷凍及解凍處理：

1.胚冷凍處理：

　　將清洗過的胚移入 5％ Glycerol／18％ FCS／dPBS 10 分鐘，然後將胚移入 10％ Glycerol／18％ FCS／dPBS 內十分鐘，接著將胚分裝於0.25ml麥管中準備進行冷凍，冷凍胚裝填入 0.25ml麥管方法如下圖所示。

　　

2.冷凍步驟：

將裝有胚之 0.25 ml 麥管，放入冷卻室
↓
將冷卻室溫度急速降到 -4.0℃
↓
調節冷卻室位置，使溫度緩慢降到 -5℃ 植冰，維持 -5℃ 約 5 分鐘
↓
調節冷卻位置，使每分鐘降溫 0.5℃
(0.3∼0.7) 到 -30∼-35℃
↓
將麥管從冷卻室取出，直接沒入液態氮筒中

　

胚簡易冷凍

  1. 　

　

3.解凍處理：

方法一：

(1)將胚管自液氮取出，置室溫五秒後再浸入 20℃ 水中， 解凍約 15∼20 秒。

(2)擦乾後，以手指握在封口粉端，稍加搖搖，使 Sucrose 與 Glycerol 混合。

(3)應用胚注入器，將封口粉端剪開，直注入子宮角末端三分之一處。

方法二：

(1)如方法一(1)融解。

(2)將胚擠入 9％ 甘油（0.3M 蔗糖 18 ％ FCS mPBS）5分鐘後再移入 6％ 甘油 （0.3M 蔗糖 18％ FCS mPBS ）再待 5分鐘後移入 3％ 甘油 0.3M 蔗糖 18％ FCS mPBS，再以 18％ FCS mPBS 清洗三次後分裝入 0.25ml 麥管後進行移置。

六、非外科胚移置：
　　牛隻固定後，尾根剃毛，硬膜外麻醉，清洗及消毒等步驟如同非外科洗胚。移置前先直腸檢查受胚牛之黃體（第七日黃體），胚以移置入同側的卵巢有黃體之子宮角為宜。卵巢異常如濾泡囊腫，兩邊卵巢萎縮，子宮收縮性強（表示發情期）均不可移置。上面步驟準備好後，即可開始進行胚移置工作。將裝有胚胎的 麥管放入可深入子宮內部有金屬套頭的塑膠軟套管內，將此軟套管嵌入移胚器前端有輪狀槽溝內，至少二個槽溝以上以防止移胚時不小心把軟管掉入子宮角用，接著將紅色推棒往前送至麥管之 棉栓位置上後，將有金屬頭的軟套管往回收至定位後鎖緊，移胚 器前端沾上 K~Y 潤滑劑後再套上滅菌過之塑膠保護套，並於前 端塗上 K~Y 潤滑劑，接著助手先將外陰部分開，技術人員則將移胚器往前送至陰道內，當到達子宮頸時，塑膠保護套往回拉，使移胚器繼續往前經過子宮頸管到達子宮體時，調整準備移胚的子宮角（左邊或右邊），放鬆移胚器後端之螺絲使金屬頭塑膠軟管往子宮角深部前進到子宮角 1/3處，即可將胚注入子宮角內，最後再將胚移置器小心抽出，即完成胚移置工作。

最近發展現況：

　　具有優秀遺傳素質，標準體格和高生產能力供胚母牛，將其超級排卵，配以優秀公牛，短期間能生產多數同時具有來自遺傳性能優良母系及父系之仔牛，能儘速提高牧場整群牛群之資質。此種能有效的達到家畜改良目的之胚移置工作，對畜產之發展將有很大的衝擊利益。現時牛胚移置工作，先進國家已經實用化，普遍推廣到田間應用。國內近年來由於胚移置技術之改進，不論新鮮胚或冷凍胚之移置成功率已達到 50 ％ 左右。將來牛胚移置工作應與牛人工授精配合使用，有效地改良國內乳牛品質。本所近年來在雜糧基金會與農業委員會支助下，著重於如何建立牛胚移置之田間應用模式，進行小規模試驗性之田間應用，將荷蘭牛胚移入代孕母黃牛子宮內或現場教導酪農安排超級排卵、協助非外科洗胚、進行胚移置及胚冷凍保存等工作。

未來展望：

　　本省氣候炎熱常致乳牛配種困難，無法全年平均供應乳源外，炎熱之氣候亦容易引起乳牛的繁殖障礙問題致提早被淘汰，因此牧場常需要大量補充女牛。從國外高價進口供產乳用之女牛，牛乳之生產成本常會增加，若能成立冷凍胚銀行，冷凍保存涼季所採集之胚，供夏季進行胚移置。或將女牛胚移置於黃牛或肉牛子宮內代懷孕，哺育乳牛之後補牛亦是增加乳牛候補牛之來源以提高飼養黃牛或肉牛經營者之收益之途徑。其次成長發育迅速甚為農民喜愛之高價位大型黃牛，也可藉胚移置技術，大量生產，以提高農民收益。因此儘速訓練更多能操作胚移置技術人員，鼓勵人工授精師或獸醫師參與胚移置工作，俾建立全省性之牛胚移置服務網，交換優良冷凍胚，進行優秀牛隻之基因傳播推廣工作為當今急需之工作，除增加酪農之優秀後補牛隻供應外，亦可節省國外購買女牛的費用來進口優良品質的冷凍胚，供乳業發展之需。