生殖細胞的冷凍      101      第四章 胚胎銀行

 

壹、豬胚的冷凍

  豬胚冷凍保存將有助於豬種基因庫之建立和豬胚移置工作國際化之拓展。單細胞、雙細胞、四細胞、八細胞、桑椹、早期囊胚、擴張囊胚到孵化囊胚期的蘭嶼豬胚冷凍存活率,分別為19.25/26)、0.00/58)、6.83/44)、6.53/46)、26.35/19)、5.91/17)、36.113/3675.6%34/45)。比較蘭嶼、藍瑞斯和杜洛克種的擴張囊胚之冷凍存活率,分別為37.319/51)、5.46/1109.4%5/53;以及比較蘭嶼、藍瑞斯和約克夏種的孵化囊胚之冷凍存活率,分別為51.534/52)、21.43/140.0%0/10)。存活並發育為擴張囊胚者經螢光染色後,其粒線體分佈呈現均勻或僅局部不均勻,大多數胚葉細胞核呈現頗一致的核相。

 

豬胚冷凍的記錄

  豬胚冷凍方式、溫度和解凍後存活率之研究文獻條列於Nagashima et al.1994報告,其中以慢速冷凍方式來冷凍擴張囊胚Kameyama et al.,1990)、孵化囊胚Oguri, 1990; Kashiwazaki et al., 1991b; Fujino et al., 1993或體外培養的孵化囊胚(Kashiwazaki et al., 1991a),均有活仔豬誕生的記錄。國內郭1993亦利用慢速冷凍方式來冷凍擴張囊胚和早期孵化囊胚,獲得一頭難產死亡的仔豬。以上數篇報告均以1.5 M 甘油為冷凍保護劑。茅與鄭1992曾比較甘油、雙甲基磺氧化物DMSO和丙二醇Propylene glycol等冷凍保護劑,探討植冰溫度和孵化前後囊胚的存活情形,證明豬囊胚的慢速冷凍保護劑以甘油較佳。Weber and Youngs1994進行冷凍保護劑毒性試驗,發現2.0 M蔗糖溶液對桑椹期至孵化期的豬胚發育有抑制現象,然1.0 M蔗糖溶液或1.0 M濃度以下者則對豬胚發育無不良影響。他們並比較不同濃度的甘油,當甘油含量高於30% 至50% 時,豬胚雖僅暴露其中30秒,豬胚的發育已受阻。不過,Dobrinsky and Johnson1993; 19946.5 M甘油來進行快速冷凍的玻璃化法Vitrification於豬擴張囊胚和孵化囊胚上,解凍存活的豬胚持續發育率並未不如對照用的胚,暗示甘油或其他種冷凍保護劑之使用濃度仍待研究。Kashiwazaki et al.1991b曾認為台灣本土豬種的孵化囊胚之耐凍力高,因而以大陸梅山豬為重要的試驗材料,並因而有產仔的記錄。Dobrinsky and Johnson1994的豬胚玻璃化冷凍試驗亦明確地指出配種後第六天和第七天的成熟囊胚經冷凍解凍後的存活率與發育率,均較配種後第五天的早期囊胚為佳。

豬胚採集與鏡檢

     本土豬種蘭嶼豬採自然配種,而外來豬種藍瑞斯、約克夏和杜洛克豬則多採人工授精,配種或授精當日為第零天。豬胚採集方式和胚期參

 

 

生殖細胞的冷凍     102       第四章 胚胎銀行

 

照陳與吳1991研究報告所述,依其外觀型態區分為單細胞期、雙細胞期、四細胞期、八細胞期、桑椹胚期、早期囊胚期、擴張囊胚期和孵化囊胚期。採集的豬胚品種和鏡檢時胚期均予以記錄後,先維持於胚培養液小滴中。胚培養液成分可參照陳等1995所列的改良 BMOC-2 培養液。

cgcp102.jpg (39670 個位元組)

豬胚:(A)單細胞胚,(B)雙細胞胚,(C)四細胞胚,(D)八細胞胚,
(E)桑椹胚,(F)早期囊胚,(G)擴張囊胚,(H)孵化囊胚。
(×400)

 

 

生殖細胞的冷凍      103      第四章 胚胎銀行

 

慢速冷凍

  鏡檢後的豬胚先移入含有 18% 胎牛血清的杜比克氏磷酸緩衝改良溶液(modified Dulbecco's PBS, mDPBS)等張數分鐘後,就依序移入含有冷凍保護劑 0.5 M1.0 M1.5 M 甘油的mDPBS冷凍溶液中,各經10分鐘後,將豬胚裝填入冷凍用麥管,其填裝方式如茅與鄭1992所述。陳等1995之報告列有mDPBS 之組成分。填裝好的封口麥管則被置放於35水溫的玻璃杯中,再以漸混入冰水方式來降溫,約1℃/分速率下降到25℃,隨即就把麥管移入緩慢冷凍降溫機(West-2050, Firstek Scientific)的酒精槽內。二分鐘後,以每分鐘降溫1速率由25降溫到 -6.8℃,然後以浸漬於液態氮中之鑷子夾觸麥管進行植冰。植冰後的麥管仍保持在 -6.810分鐘後,再改以每分鐘 0.3的速率降溫到 -35℃,停留五分鐘後就把麥管直接投入液態氮中保存於 -196液態氮桶內。

豬胚的解凍

      冷凍豬胚的解凍步驟是把麥管由液態氮桶抽出後,直接投入37水浴槽中,約需20秒後,取出已回溫的麥管並拭去管外的水漬。剪去封口端,把其中的解凍胚擠出並置放於 0.30 M蔗糖溶液中,靜置10分鐘後,再移置入0.15 M蔗糖溶液中靜置10分鐘,藉以透析出甘油冷凍保護劑。最後把胚移入含有18%胎牛血清的 mDPBS中,鏡檢其外觀完整性。把完整的豬胚置放於胚培養液,放入37℃、5% CO2培養箱,經24小時後記錄其存活發育狀況。豬胚解凍後,仍呈現完好的透明帶和胚外型者所佔冷凍胚數之百分比為完整率。豬胚解凍後之存活率是以培養後可進一步發育的胚數所佔冷凍胚數之百分比表示之。

       豬胚經解凍並體外培養 24 小時後,予以螢光染色。採用粒線體特定染劑薔薇紅 (Rhodamine 123, R-8004, Sigma, St. Louis, MO, USA ),其濃度為 30μg/ml,調製溶液為杜比克氏改良溶液但內含 4μg/ml 的牛血清白蛋白。為避免自發性螢光干擾發生,溶液中不可含有酚紅。存活豬擴張囊胚和螢光染液混合後,就可把每個胚放於載玻片上,並利用凡士林來固定好蓋玻片角落,經40倍放大倍數的物鏡 (Zeiss, ×40/0.75 OEL)和10倍放大倍數的目鏡,以激光濾片 BP 450-490 nm 和吸光濾片LP 515 nm,來觀察豬擴張囊胚的粒線體分佈相 (Luoh and Wu, 1996)經薔薇紅染色後的豬擴張囊胚,可再經螢光染劑 Hoechst 33342 來標定出囊胚細胞核。Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO)以蒸餾水來配製成 1 mg/ml 備用溶液備用。使用時,取10 μlHoechst 33342溶液0.75 ml2.3% Sodium citrate dihydrate 溶液和0.25 ml 的酒精,混合成Hoechst 33342 染色液。染色步驟上,首先把 15 μl 0.1% Trypan blue ( 溶於 2.3% Sodium citrate dihydrate溶液中)滴在胚上,經三分鐘後,再把 15 μl

 

 

生殖細胞的冷凍      104      第四章 胚胎銀行

 

Hoechst 33342 染色液再滴上,蓋上蓋玻片,置於 37培養箱或工作台,經五分鐘後就可進行螢光鏡檢,激光濾片為BP 340-380 nm 和吸光濾片為430 nm (Pursel et al., 1985)

cgcp104.jpg (8133 個位元組)

薔薇紅(Rhodamine 123)染色後的豬胚:(A)精子,(B)未成熟卵,(C)成熟卵,(D)單細胞胚,(E)雙細胞胚,(F)四細胞胚,(G)八細胞胚,(H)十六細胞胚,(I)桑椹胚,(J)擴張囊胚,(K)孵化中囊胚,(L)孵化囊胚。

 

 

生殖細胞的冷凍      105      第四章  胚胎銀行

 

不同胚期蘭嶼豬胚的耐凍性

  蘭嶼豬是境外移入蘭嶼島適應後的迷你型豬種,是國家保種動物之一(張等1993李等1994)挑選具有完整的透明帶和胚細胞發育型態良好的26個單細胞胚,58個雙細胞胚、44個四細胞胚、46個八細胞胚、19個桑椹胚、17個早期囊胚、36個擴張囊胚、和45個孵化囊胚,合計291個胚,進行慢速冷凍。不同胚期的蘭嶼豬胚經慢速冷凍至 -196℃,解凍後總計有95.8% (279/291)的胚仍呈現完好的透明帶和胚外型,然經24小時的體外培養後,僅有22.0% (64/291)的胚存活並可發育至下一胚期。不同胚期的存活率依細胞數期由單細胞、雙細胞、四細胞、八細胞、桑椹胚、早期囊胚、擴張囊胚到孵化囊胚,分別為19.2 (5/26)0.0 (0/58)6.8 (3/44)6.5 (3/46)26.3 (5/19)5.9(1/17)36.1(13/36)75.6%(34/45)顯示擴張囊胚和孵化囊胚經冷凍解凍後,仍保有發育能力。

cgcp105.jpg (7287 個位元組)

解凍的擴張囊胚經體外培養24小時後進入
孵化期:(A)孵化早期和(B)孵化中期。

 

 

      生殖細胞的冷凍                         106                    第四章      胚胎銀行
 

      豬胚經冷凍解凍步驟後,會有退化的損傷情形,乃其對溫度敏感的耐受溫度在15所致Polge et al., 1974; Wilmut, 1986),當溫度低於15後其細胞內的脂肪滴影響到冰晶的形成,且常會有大小不一的結果Jondet et al., 1984; Toner et al., 1986),終致細胞膜上脂肪組成受損,故解凍後會有細胞破裂或退化現象Polge and Willadsen, 1978; Wilmut, 1986)。因此,進行豬胚冷凍時的胚細胞內脂肪組成含量間接影響到胚解凍後存活的機率Toner et al. (1986)認為二至八細胞期豬胚無法忍受 -15以下的溫度,可能與細胞中存在高含量脂肪球滴有關。這種脂肪球滴不利冷凍效應亦在囊胚期被視為關鍵要素(Nagishima et al., 1992)Nagishima et al. (1994)把單細胞胚離心後,以顯微針吸掉脂肪團,一者立即冷卻至 4℃,或者體外培養使之發育成雙細胞胚與四細胞胚後再冷卻至4℃,分別有18.4% (9/49) 44.4% (20/45)的冷卻胚回溫後,可持續地發育至816細胞期,證實細胞內的中性脂肪球滴不利於豬胚冷凍。蘭嶼豬的單細胞胚仍有19.2%存活,暗示中性脂肪球滴的負面效應並非絕對的,有可能有種別差異存在因素需加以考慮。

     豬桑椹胚期冷凍試驗報告中Nagashima et al. (1989)1.5 M DMSO 為冷凍保護劑,保存於 -20℃,解凍後無一存活。採用 1.5 M甘油來凍存蘭嶼豬桑椹胚19個,有26.3% (5/19)存活,雖然暗示是冷凍保護劑差異所致,但亦可能是冷凍步驟或豬種差別所致。就早期囊胚、擴張囊胚和孵化囊胚之冷凍存活率來看,囊胚的發育期是一重要的關鍵,正如Nagishima et al. (1994) 條列出有仔豬誕生的研究文獻所述,冷凍豬擴張囊胚至孵化囊胚是目前可行的胚期 (Kameyama et al., 1990; Oguri, 1990; Kashiwazaki et al., 1991a,b; Fujino et al., 1993; 1993)在以 2 M DMSO1 M Acetamide 3 M Propylene glycol 的混合冷凍保護液,進行豬囊胚急速冷凍試驗中,Yoshino et al.(1993) 認為中國梅山豬純種胚或其雜交胚存活率較歐美豬種為高,並推論其差異有可能是導源於豬胚耐滲透性和耐凍性的種別差異。

 

不同品種的豬囊胚耐凍性

      共選用蘭嶼、藍瑞斯、杜洛克和約克夏等豬種之成熟囊胚共292個。成熟囊胚又分為擴張囊胚和孵化囊胚。其中蘭嶼豬擴張囊胚51個和孵化囊胚52個、藍瑞斯豬擴張囊胚110個和孵化囊胚14個、約克夏豬孵化囊胚10個、杜洛克豬擴張囊胚53個和孵化囊胚2個被冷凍解凍和體外培養。豬胚解凍時發生破損的情況並未發現。而蘭嶼、藍瑞斯和杜洛克豬擴張囊胚於24小時的體外培養後,其存活率分別有37.3 (19/51)5.4 (6/110)9.4% (5/53)孵化囊胚的冷凍存活率在蘭嶼、藍瑞斯和約克夏品種分別為51.5 (34/52)21.4 (3/14) 0.0% (0/10)蘭嶼豬胚顯著地具有較高

 

 

生殖細胞的冷凍      107      第四章 胚胎銀行

 

的耐凍性(P<.01)在僅有兩個杜洛克豬孵化囊胚的冷凍試驗,兩個胚均存活,暗示豬胚個體間差異亦應考量。

      Wu and Lee (1996) 急速冷凍豬卵試驗中,以薔薇紅螢光染色劑來觀察解凍後存活卵之粒線體分佈相,指出粒線體原本均勻分佈相會受到冷凍破壞,而產生顆粒狀和片塊狀聚集,不利於其後續的存活。Luoh and Wu (1996)發現發育延滯和退化的豬胚有嚴重地粒線體異位和聚集現象。當以薔薇紅來染這些發育中的擴張囊胚,其胚葉細胞的螢光染色有的很均勻,亦有的較不均勻。詳細審視各胚葉細胞的核染色狀態,有些細胞似正進行細胞核分裂,然大多數胚葉細胞核均呈現較一致性的核相,此乃暗示其在擴張囊胚期,尤其環繞在外的滋養層細胞似可有一致性的分裂程度。

cgcp107.jpg (7452 個位元組)

豬擴張囊胚解凍後先以薔薇紅染色(左圖),再以Hoechst 33342
染色(右圖),胚葉細胞核呈現紫藍色。
×1000

豬胚凍傷

       比較不同品種豬胚耐凍性結果,雖證實本土豬種蘭嶼豬有較高的存活率,但移置後仍未有產仔紀錄,可見冷凍對豬胚的損傷不能僅以著床前的發育做為惟一的指標。豬胚冷凍存活率之種別差異的存在,是否可進一步以細胞生理生化上的差異來探討,將有助於提昇豬胚冷凍存活率。從Kashiwazaki et al. (1991b)的慢速冷凍結果和Yoshino et al. (1993) 的急速冷凍結果得知,採用中國豬種為試驗材料,較能突破冷凍技術瓶頸。由於粒線體DNA含有細胞能量ATP生成的必要基因 (Anderson et al., 1981)故粒線體在細胞質裡的分佈相是否受到冷凍損傷漸受到重視(Noto

 

 

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et al., 1993; Wu and Lee,1996; Luoh and Wu, 1996)Onishi et al. (1994)應用粒線體DNA的限制脢Bgl 分切點來區分嵌合豬的細胞源,梅山豬僅有一個Bgl 分切點,而藍瑞斯豬有三個切點。薛與吳 (1993) 把國內桃園、蘭嶼、藍瑞斯、約克夏和杜洛克等豬種,依其Bgl 分切點區分為三大類,桃園和約克夏豬僅有一分切點,蘭嶼豬有兩個分切點,而藍瑞斯和杜洛克豬有三個分切點。因此,進一步以電子顯微鏡來比較冷凍存活豬胚的粒線體,或藉助低照度螢光顯微鏡來分析細胞核相有無差別,不僅可瞭解豬胚細胞的胞器變化,亦可探討遺傳上的差異性。Iwasaki et al.(1994) 採用螢光染色法比較在 -196冷凍保存後,豬擴張囊胚和孵化囊胚的內細胞群型態受到冷凍的影響,發現未經冷凍的豬胚內細胞群細胞輪廓極為清晰,但經冷凍後的豬胚內細胞群細胞輪廓則產生變型和異位現象。他們同時發現內細胞群細胞緊密度在冷凍存活的擴張囊胚和孵化囊胚中,僅有18至38% 的胚相似於新鮮胚狀態,但存活的擴張囊胚和孵化囊胚內細胞群活細胞數並未受到冷凍影響。因此,豬囊胚冷凍保存技術將因螢光染色技術的協助而會有突破性發展。

胚移置的疾病防疫

  目前國內外冷凍存活資料,均顯示以孵化囊胚來進行冷凍保存遠好於其他胚期,但就胚移置的疾病防疫工作上將不符引種的現有規定。一般上,若有透明帶完整地包裹著豬胚時,可進行洗滌工作來消除豬胚外圍的可能病源物體Medveczky et al., 1996)。那麼,探討豬胚冷凍前後的生理生化差異,再調整冷凍解凍步驟,使豬胚冷凍技術有重大突破,將有助於豬胚種原庫之建立和豬胚國際交流工作之推動。

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