生殖細胞的冷凍　　　　　　111　　　　　　第四章　胚胎銀行

貳、牛胚的冷凍

　　自從1951年美國威斯康辛州誕生第一頭牛胚移置的仔牛後(Willett et al., 1951)，直到1973年才由Wilmut博士和Rowson博士成功地把牛胚冷凍，並移置後產下兩頭仔牛(Wilmut and Rowson, 1973)。我國在1986年的冷凍胚首例，是在畜產試驗所恆春分所溫上湘先生和林光華先生利用荷蘭乳牛品種的胚，經慢速冷凍法，以甘油為冷凍保護劑，解凍時以蔗糖液來透析，再移置到聖達肉牛品種六頭母牛，懷孕率為33.3﹪(2/6)，產下一頭仔牛。

牛胚之採集

      以FSH行超級排卵，並在配種後第六至七天用非手術法採集胚。新鮮胚之移置，則採用PGF-2-alpha處理，以調整作供胚牛及受胚牛間之發情同期化。受胚牛含經產母牛及女牛。

冷凍胚之製作

      鏡檢後的牛胚先移入含有 18% 胎牛血清的杜比克氏磷酸緩衝改良溶液（modified Dulbecco's PBS, mDPBS）等張數分鐘後，就依序移入含有冷凍保護劑 5%和10% 甘油的mDPBS冷凍溶液中，各經10分鐘後，將胚裝填入冷凍用麥管，其填裝方式如李等（1993）所述。填裝好的封口麥管則被置放於35℃水溫的玻璃杯中，再以漸混入冰水方式來降溫，約1℃/分速率下降到20℃，隨即就把麥管移入緩慢冷凍降溫機（West-2050, Firstek Scientific）的酒精槽內。二分鐘後，以每分鐘降溫1℃速率由20℃降溫到-6℃，然後以浸漬於液態氮中之鑷子夾觸麥管進行植冰。植冰後的麥管仍保持在-6.8℃達5分鐘後，再改以每分鐘 0.3℃的速率降溫到-35℃，就把麥管直接投入液態氮中保存於 -196℃液態氮桶內。

胚的傳統三步驟緩慢稀釋解凍

       冷凍胚的解凍步驟是把麥管由液態氮桶抽出後，直接投入20℃水浴槽中，約需30秒後，取出已回溫的麥管並拭去管外的水漬。剪去封口端，把其中的解凍胚擠出並置放於有6.6%甘油的 0.30 M蔗糖溶液中，靜置10分鐘後，再移置入有3.3%甘油的 0.30 M 蔗糖溶液中靜置10分鐘，再移置入有 0.30 M 蔗糖溶液中靜置10分鐘，藉以透析出甘油冷凍保護劑。最後把胚移入含有18%胎牛血清的mDPBS中，鏡檢其外觀完整性。把完整的胚置放於胚培養液，放入37℃、5% CO₂培養箱，經24小時後記錄其存活發育狀況。胚解凍後，仍呈現完好的透明帶和胚外型者所佔冷凍胚數之百分比為完整率。胚解凍後之存活率是以培養後可進一步發育的

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胚數所佔冷凍胚數之百分比表示之。

一步驟解凍直接移置法

　　一步驟解凍直接移置法是胚裝填入冷凍用麥管時，改用1M蔗糖溶液取代兩邊的10% 甘油的mDPBS。冷凍胚的解凍步驟是把麥管由液態氮桶抽出後，直接投入20℃水浴槽中，約需30秒後，取出已回溫的麥管並拭去管外的水漬，把麥管中氣泡上浮後，使內容物靜置10分鐘，就直接移置入受胚牛的子宮內。

　　李善男等人(1993)以電腦自動降溫設備來自製冷凍胚，胚之包裝及移置前之解凍方式，分為傳統三步驟緩慢稀釋解凍後移置法，以及一步驟解凍直接移置法。試驗結果顯示，應用新鮮胚之懷孕率為30.0%(6/20)，應用冷凍胚則為32.5%(13/40)。總移置懷孕率則為31.7%(19/60)。其中經產牛之懷孕率為13.8%(4/29)、女牛為48.4%(15/31)。自製冷凍胚以緩慢解凍法移置之懷孕率為30.8%(4/13) ，而直接移置法僅6.3%(1/16)。進口冷凍胚來自美國，胚以三步驟緩慢稀釋解凍後，均經品質檢查屬二級以上才予使用。於1992年自美國進口冷凍胚，胚以三步驟緩慢稀釋解凍後，均經品質檢查屬二級以上才予使用，進口之冷凍胚的懷孕率為72.7%(8/11)。由資料顯示，在胚置入前，胚品質鑑定以及冷凍製備技術為提高胚移置成功率之必要條件。

胚性別鑑定

　　許登造等人(1995)利用聚合脢連鎖反應(PCR)判定牛胚之性別，先利用已知性別牛隻之週邊血液內淋巴球之DNA當作模版，以四種不同之牛Y染色體特異DNA探針(Primer)和雌雄均有的牛生長素(Growth Hormone)DNA進行PCR擴增，所得擴增產物經電泳及螢光判讀，雄性為兩條螢光帶，而雌性為一條螢光帶。四種不同DNA探針的性別判定正確率分別為38%、50%、94%和100%。同時以同胚之兩個半切胚進行PCR性別鑑定，6個半切胚均能判定為同樣性別。利用0.5ml試管進行PCR性別鑑定約需6-7小時，如改以毛細管進行PCR性別鑑定，可縮短至2小時完成，但判定正確率較低。

　　牛胚予以分切或胚葉細胞檢測(Biopsy)後，一半供作PCR性別分析，一半予以冷凍保存。此種半切胚以1.8M Ethylene glycol冷凍保存，無透明帶和海藻酸鈉微膠包埋者，解凍後之存活率，分別為88%和83%；而以1.3M 甘油冷凍保存，無透明帶和海藻酸鈉微膠包埋者解凍後之存活率分別為87%和81%。16個冷凍半切胚，解凍後移置4頭受胚牛，其中一頭分娩3頭犢牛，為與性別判定相同者之參胞胎仔牛。此外，牛胚採胚

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後先予以冷凍保存，待移置時再加以分切或胚葉細胞檢測其性別。22個半切胚經測定後雌雄性別各佔一半。惟冷凍胚經分切後培養至性別可判讀時，胚生存能力已下降，因此先予以移置，結果獲得一頭正常仔牛，但此仔牛係未能性別鑑定成功之半切胚所出生。

參考文獻

溫上湘、林光華。1986。非外科手術移植自製牛冷凍胚在台灣成功之首例。畜產研究 19(1): 31-39。

李善男、蕭振文、徐炘松、楊振榮、許登造。1993。乳牛胚之移置研究(II)新鮮胚及冷凍胚之田間應用。畜產研究 26(4):327-333。

許登造、楊爵閣、許恭豪。1995。PCR性別鑑定和生體剝檢後的牛胚微膠囊包埋及冷凍保存之研究。中國畜牧學會會誌24(2):139-151。

Willett, E. L., W. G. Black, L. E. Casida, W. H. Stone and P. J. Buckner. 1951. Successful transplantation of a fertilized bovine ovum. Science 113:247.

Wilmut, I. and L. E. A. Rowson. 1973. Experiments on the low temperature         preservation of cow embryos. Vet. Rec. 92: 686-690.

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亞洲週刊訪問報導…….

「畜產試驗所接受行政院農業委員會的保種計畫，企圖研發一項可挽救瀕臨絕種的蘭嶼小耳迷你豬，是一項胚胎期細胞核的複製工作，最早於1991年3月3日，誕生一批8頭核轉置豬，離乳時存活1公4母。」