生殖細胞的冷凍        63     第三章 卵子銀行

 

壹、豬卵的冷凍

  豬卵取自經PMSGHCG注射誘發排卵的蘭嶼品種新母豬。HCG注射後4246小時,利用外科手術沖集新母豬輸卵管內的卵。沖集所得之卵,分別以有或無添加第三型抗凍蛋白質(Antifreeze protein type III20 mg/ml)之含1.5M的甘油的mDPBS溶液逐步平衡之。然後分裝於0.25ml麥管,再由25℃以每分鐘降1℃之速率降溫到-6.8℃,植冰並維持-6.8℃達10分鐘後,以每分鐘0.3℃的速率降到-30℃,2到3分鐘後直接移入液氮中保存。解凍時,麥管自液氮桶取出後就直接投入30℃溫水,待麥管內容物融解後,以蔗糖溶液逐步脫去甘油。試驗結果顯示,已排出第一極體、未包覆有卵丘細胞之成熟卵,其於有或無添加抗凍蛋白質的甘油抗凍液中冷凍解凍後,仍保有完整透明帶及卵細胞型態者,分別為79%(45/57)61%(25/41)而未排出第一極體之卵細胞,不論甘油抗凍液中是否添加有抗凍蛋白質,冷凍解凍後有透明帶碎裂或卵細胞皺縮等失去正常之細胞型態之狀況,保有正常卵細胞型態和完整透明帶比率,兩者均為0%。解凍的成熟卵49個分為三組,分別授予50025005000個獲能精子/卵,有15%(3/20)25%(5/20)67%(6/9)的體外受精卵可發育至桑椹胚。

卵冷凍保存的起步

  家畜生殖細胞(包括精子、卵細胞及胚)之冷凍保存,不但可以提供做為家畜種原保存的一種方式,也是一種經濟有效的引種或種原交換與交流的手段。透過這個技術的推廣及應用,可以迅速而廣泛地傳播優良的基因,以促進畜群的性能表現,並提昇育種改良之速率。在生命科學研究上,家畜生殖細胞的冷凍更可以用以提供大量的研究材料,並可做為生殖細胞操縱時之支援技術。家畜生殖細胞的冷凍保存肇始於精子冷凍技術之開發(Polge et al., 1949)而家畜胚之冷凍,在以小鼠胚(Whittingham et al., 1972)為材料發展成功後,牛胚(Wilmut and Rowson, 1973)綿羊胚(Willadsen et al., 1974)山羊胚(Bilton and Moore, 1976)及馬胚(Yamanoto et al., 1982)也相繼有冷凍成功且冷凍胚移置後成功產仔之結果。家畜卵細胞之冷凍保存的發展較精子及胚者為晚;且不若精子和胚之冷凍保存已進入商業應用之階段,大多尚處於試驗研究階段。卵細胞目前已有解凍後存活並仍具有受精能力者,有小鼠(Tsunoda et al., 1976)倉鼠(Selman and Anderson, 1975)大鼠(Kasai et al., 1979)、兔(Tsunoda and Sugie, 1977)等小型試驗動物和人類(Diedrich et al., 1986),惟其成功的百分率均遠比胚冷凍者為低 (Marrs et al., 1989)家畜之卵冷凍保存,目前仍只是在起步和嘗試的階段(Schroeder, 1988; Rubinsky et al., 1991, 1992ab; Didion et al.,

 

 

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1993; Hochi et al., 1994);尤其是豬卵也和豬胚的冷凍保存一樣(茅和鄭,1992; Nagashima et al., 1992)有許多困難尚待克服。

卵母細胞的急速冷凍

  吳與李(1996)自屠宰場取回147頭肉豬的卵巢,共計回收3,863個卵母細胞,平均每頭豬有26.3+17.4個卵母細胞。卵細胞外加透明帶後之直徑為130140150160170 um寬者,分別有6.56.533.931.8和21.3%。扣除透明帶裂損和卵細胞質型態不良後,有97.5%(3,768/3,863)卵被侵入九種冷凍保護溶液,是以DMSOEthylene glycolPropylene glycolAcetamideFicoll 70Trehalose等冷凍保護劑配方來組成,共計九種,經10分鐘後,吸填入0.25ml麥管封口後,就直接投入液態氮保存。此種直接投入液態氮保存方法,又名玻璃化冷凍(Vitrification),是一種急速冷凍技術。為了探討個體間的差異,故每頭豬的豬卵均個別標示,平均每頭可冷凍的卵數有25.6+16.4個。

  解凍時,直接把取自液態氮桶的麥管投入20oC水浴槽,使之融解,一分鐘後取出並擠出解凍卵於0.5M蔗糖溶液,10分鐘後鏡檢其外觀是否完整,平均有23.4+16.9個卵仍具有完整的透明帶和正常的卵細胞型態,再移置於18%FCSmDPBS培養20分鐘,有14.8+14.2個卵存活。解凍存活的豬卵完整率(完整卵數/冷凍卵數)為90.6+21.9%卵存活率(存活卵數/冷凍卵數)為58.9+37.7%。解凍卵以40% Ethylene glycol18% Ficoll 70溶液調配成的混合溶液為冷凍液,其調製比例為2:1、3:1或3:2時,解凍卵之存活率平均為818297%藉助粒線體特定螢光染色劑Rhodamine 123可看出卵細胞質粒線體分布。解凍卵存活者經螢光染色後評分,呈現如新鮮卵均勻狀態者有12.2%,局部不均勻者有17.3%,以及有70.5%卵呈現粉圓顆粒狀粒線體聚合體。解凍存活的豬卵543個再經二次冷凍,解凍後仍完整者有91%(494/543)存活者73%(399/543)存活卵經螢光染色後,其粒線體已發生大顆粒聚集狀(34.0%)空洞化(16.8%)和片塊狀(22.0%)僅有2.6%呈現次均勻分布和24.6%呈粉圓狀顆粒。二次冷凍卵的存活率和第一次冷凍卵的存活率無關(r=-0.13P>0.46)暗示極速冷凍方式不因個體差異而受到影響。

輸卵管內沖集豬卵

  豬卵細胞係以外科手術法採集自以激性腺素誘發排卵之本土品種蘭嶼種新母豬。每頭新母豬於其後脅部以皮下注射的方式給予1000國際單位之孕馬血清激性腺素Prengant mares serum gonadotropin, PMSG血清哥娜,三共臟器株式會社),72小時後再於其腎部肌肉注射500國際單位之人類絨毛膜激性腺素(Human chorionic gonadotropin, HCG哥娜,中

 

 

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國化學製藥)。並於HCG注射後42到46小進行腹部外科手術,以含0.4%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA, Fraction V)mDPBS來沖集其輸卵管內之卵細胞,卵細胞型態完整和有被覆之卵丘細胞做為冷凍用豬卵,再依有無第一極體排出來區分極體形成前或極體形成後豬卵兩群供試。極體形成的豬卵之卵丘細胞已擴散,而極體形成前的豬卵被覆在外的卵丘細胞較緊密,需先以0.5%硫璃醣去氫酵素來軟化並去除之。因此,所有供試的豬卵均已去除卵丘細胞。

cgcp65.jpg (27194 個位元組)

豬解凍存活卵經螢光染色後,其粒線體分布均勻(A)、次均勻分布(B)
、呈粉圓狀顆粒(C)、發生大顆粒聚集狀(D)、空洞化(E)和片塊狀(F)。

 

 

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冷凍保護劑之添加

  所使用之冷凍保護劑為甘油(Glycerol, Sigma)豬卵細胞以含0.4%牛血清蛋白之mDPBS洗滌三次後,置於含16%FCSmDPBS中靜置平衡15分鐘。再將卵細胞移入含0.5M甘油與16%FCSmDPBS平衡10分鐘,之後將極體形成前和極體形成的卵細胞再逢機次分為兩群,分別移入含20mg/ml第三型抗凍蛋白質(Antifreeze protein, AFP, type )1.5M甘油及16% FCS mDPBS1.5M甘油與16% FCS 之mDPBS 中,待5分鐘後,則分別裝填入0.25ml之塑膠麥管中,並於3分鐘內送到25℃之可程式控制的酒精降溫槽(West-2050, FirStek Scientific, USA)中,開始冷凍降溫之操作。第三型抗凍蛋白質是純化自大洋鯰Ocean pout)。

豬卵的慢速冷凍

  裝有豬卵之麥管以直立方式放置於25之可程式控制酒精降溫槽中,二分鐘後,以每分鐘降溫1℃的速率由25降溫到-6.8℃,然後以浸漬於液氮中之鑷子夾觸麥管植冰部位以進行植冰。植冰後保持-6.8達10分鐘後,再以每分鐘0.3的速率降溫到-30℃,維持2到3分鐘後,便將麥管直接投入液氮中保存。

豬卵解凍

  將凍存於液氮中的豬卵麥管取出,直接浸入30之溫水中,並於溫水中搖動麥管。待麥管內容物融解時,即自水中取出,以70%酒精棉花消毒外壁後,剪去棉栓部位,而將內容物移入有2ml之含1.5M甘油與0.3M蔗糖和16%FCSmDPBS中放置10分鐘之後,將卵細胞置入1 ml的含0.15M蔗糖與16%FCSmDPBS中,放置5分鐘後,逐滴加入含16%FCSmDPBS使溶液的體積於5分鐘內到達 2 ml。然後以含16%FCSmDPBS洗滌三次後,培養於含16%FCSmDPBS中。然後以干涉相位差顯微鏡觀察評估卵細胞經冷凍解凍後之型態變化。

  不同發育期豬卵(極體形成前後的豬卵)以甘油為冷凍保護劑,利用緩慢降溫且冷凍保存於液氮中,經解凍後,已排出極體的成熟豬卵細胞,無論有否於其抗凍液中添加第三型抗凍蛋白質,冷凍解凍後的豬卵均有六成以上尚保持有完整的透明帶和正常之卵細胞型態。而在相同的操作條件下,尚未排出極體的豬卵細胞,即使以甘油為冷凍保護劑並添加抗凍蛋白質,解凍後均未保有完整之透明帶及卵細胞型態,而呈現透明帶嚴重破損甚至破裂,且卵細胞本身或皺縮、裂解,甚至逸散出透明帶外等等不可復原的損害。由此可知,即使同為單細胞型態的卵細胞,然其發育階段的不同,亦會產生對耐凍能力的明顯差異。Rubinsky et al. (1992b)曾指出,卵細胞在冷凍過程中的損傷,可能是由於細胞膜對鈣和鉀離子

 

 

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的通透性控制能力,因受制於冷凍過程時細胞的代謝能力低落,而致細胞內容物之離子不平衡所造成。是否卵細胞在成熟過程中細胞膜特性或電位性之變化,使鈣、鉀離子通透性之控制能力改變,而使其成熟後之耐凍性優於未成熟者,則有待進一步之證實。另從豬卵細胞成熟與否在相同條件下予以冷凍解凍後,其透明帶完整性的差異可知,豬卵細胞的成熟程度可能會影響其透明帶對冷凍解凍過程之耐受力。惟是否豬卵細胞之透明帶的理化特性、結構及成分組成,在其成熟的過程中會有所改變,致使其耐凍性提昇,而間接地提高了豬卵細胞於成熟後的耐凍能力;或者在豬卵細胞抗凍力的決定上,透明帶本身即是主要的影響因素,則仍需進一步的探討。

  以甘油為豬卵細胞的冷凍保護劑,配合緩慢降溫法進行超低溫冷凍時,豬卵細胞維持其解凍後細胞膜及透明帶完整之能力,受到卵細胞本身成熟與否之影響頗大。而抗凍蛋白質之添加雖可提昇成熟豬卵細胞外型之耐凍力,但對未成熟之豬卵細胞之耐凍能力則無助益。Arav et al. (1994)認為抗凍蛋白質類型和使用濃度在家畜卵胚慢速冷凍上極為重要,通常僅需使用1mg/ml的第一型或第三型抗凍蛋白;並指出牛羊胚若使用10mg/ml以上的高濃度抗凍蛋白將不利於其存活力,但又認為玻璃化冷凍時的最適濃度為40mg/ml。採用20mg/ml濃度於豬卵慢速冷凍步驟中,對極體已形成的成熟豬卵冷凍保存效率提昇了18%,且未影響到解凍卵之體外受精與發育,暗示第三型抗凍蛋白若使用於玻璃化之冷凍豬卵時,所使用的濃度可能高於40mg/ml才宜。

解凍卵之體外受精與培養

  已排出第一極體的成熟豬卵,經冷凍解凍後呈現完整的透明帶和卵細胞型態者,則依鄭(1985)之論文所述體外受精方式來檢測解凍卵的存活與受精能力。每個卵授予不同精子數50025005000等三組,精卵混合液置於39恆溫箱中,以95%之相對濕度,5%二氧化碳及95%空氣等條件培養8小時,培養終了時所有豬卵經早期胚培養液洗滌,藉以除去其表面多餘之精子。這些受精卵則培養於早期胚培養液24小時,再予以培養在20%FCSmDPBS,每天更換一次,鏡檢其發育為桑椹胚的百分率。

  冷凍解凍後仍具有完整的透明帶的卵細胞型態的成熟豬卵,依每個卵授予50025005000個獲能精子後,經培養發育成桑椹胚的百分比分別為15%(3/20)25%(5/20)67%(6/9)結果顯示每個卵的授精精子數增加,有助於增加卵的受精和發育成桑椹胚的百分率。在受測的49個解凍卵,有14個受精並發育為桑椹胚,顯示豬卵經冷凍解凍後仍具有完好

 

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的發育能力。

培養胚期滯留

  豬卵在冷凍前均已去除卵丘細胞,故體外受精的獲能精子數減少,企圖避免多精入卵現象。最近的國外體外受精研究報告均指出豬卵丘細胞並非精卵結合的重要因子,卵丘細胞的存在並未減少多精入卵百分率或增加受精卵發育成囊胚的情形(Suzuki et al., 1994; Wang et al., 1994)慢速冷凍的49個解凍卵經體外受精後,雖有29%可發育成桑椹胚,但面臨如Funahashi et al., (1994)所述的培養胚期滯留現象而無法繼續發育成囊胚,囊胚期的胚可以非外科方式來移置入受胚豬。因此,研發一套卵冷凍、體外受精與早期胚培養系統在豬人工生殖技術田間應用上極為迫切。

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cgcp70.jpg (15333 個位元組)