生殖細胞的冷凍       71      第三章 卵子銀行

 

貳、兔卵的冷凍

  兔卵取自成熟的白色紐西蘭種母兔11頭和毛皮生產用的雷克斯種母兔四頭之卵巢。卵巢先以組織培養液mDPBS來洗滌三次,再放入含有18%胎牛血清的培養液中,以刀尖刺破卵巢上濾泡,平均每頭兔可回收到15個卵,數目1至78不等。兔卵的急速冷凍用保護為Ethylene Glycol (EG)Ficoll (F70)分別先以18%胎牛血清的mDPBS來調配成40% EG18% F70溶液,兩種溶液再以2:1容積比調和成最終冷凍溶液。共計有182個卵吸置入冷凍溶液中,每頭兔卵分吸填入0.25ml麥管,封口後至已浸置10分鐘時,訧把麥管直接投入液態氮,完成急速冷凍步驟。解凍時,冷凍麥管自液態氮桶取出訧直接投入20℃ 水浴槽,一分鐘後取出再擠出解凍卵於1.0M蔗糖溶液中,經10分鐘後檢視外觀完整的卵,完整率為82.4±20.2%完整的解凍卵經檢出並培養於18%胎牛血清的mDPBS中20分鐘,存活率為77.5±20.3%存活卵的直徑為145.2±17.1um,透明帶厚度為18.5±2.8um卵細胞直徑為108.0±14.9um存活卵經活性Rhodamine 123螢光染色後,觀察其粒線體分佈均勻等級,有2.8%的存活卵仍具有如新鮮卵般的均勻分佈相,餘依序有11.223.414.022.426.2%的存活卵之粒線體分佈呈次均勻分佈、粉圓狀聚集、油滴狀佈、蜂巢式孔洞和片塊狀。

兔是誘發排卵的動物

  母兔不像其他家畜豬牛羊馬,有明顯的動情週期,是屬於誘發排卵者。其發身後的卵巢濾泡會受到FSH的刺激而發育,發育成熟的濾泡會產生動情素,致母兔有接受公兔配種的意願產生,持續1214天之久。這段時間內母兔若未被駕乘配種,則濾泡自行退化,有四天不肯接受公兔配種(陳1989)母兔經配種駕乘的刺激後約10小時,每側卵巢可排出5至10 個成熟卵。

  母兔人工生殖技術研發項目中,兔人工授精(黃1989)和胚移置之(鄭與朱1992在台灣已被養兔業普遍接受。兔胚體外培養(唐等,1990唐等1991顏等1994與精液冷凍保存(謝等1992均有產仔報告。而兔卵與兔胚冷凍保存技術之研發將有助於國際間種原交流工作和基因轉殖研究。

兔卵之取得

  白色紐西蘭母兔11頭和毛皮生產用的雷克斯種母兔4頭之卵巢,經以腹部外科摘除,就把摘下的卵巢先浸入組織培養液mDPBS (Gibco, Grand

 

 

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Island, NY, USA)中並洗滌三次,再放入含有18%胎牛血的mDPBS中。使用解剖刀的刀尖或針尖來刺破卵巢上的濾泡,以之回收濾泡內的兔卵。

兔卵冷凍

  Kasai et al. (1992)40% Ethylene Glycol (EG) + 18% Ficoll 70 (F70) + 0.3M蔗糖溶液來當兔胚冷凍保護液,發現兔桑椹胚經急速冷凍和解凍移置試驗,有65%的解凍胚可孕育成胎兒和仔兔Vicente and Garcia- Ximenez   (1994)比較急速冷凍方式和電腦程式化降溫的慢速冷凍方式,以40% EG或再配合Dimethyl Sulfoxide 來冷凍兔胚,指出配種三天採集到的兔胚,經急速冷凍者之存活率明顯地高於慢速冷凍者。基於此,兔卵以 40% EG+18% F70為冷凍溶液來進行急速冷凍。

  卵細胞質易因冷凍解凍而產生微細變化Didon et al. (1990)曾以Trypan BlueFluorsevein diactate (FDA)來檢測豬卵冷凍解凍後之存活性。但因Trypan Blue和FDA染色後的卵無法再繼續培養,故Noto et al. (1993)利用細胞質裡粒線體特定用活性螢光染色劑Rhodamine 123來觀察冷凍解凍後的人卵和胚,認為線體顆粒若聚集成雪花片狀,則無法一步培養發育。Lyoh and Wu (1996)亦利用Rhodamine 123來染豬胚,發現發育遲滯的胚有米粒狀和片塊狀粒線體線聚集。Wu and Lee (1996)利用 Rhodamine 123 來染急速冷凍的豬卵,發現豬卵若再經二次冷凍,粒線體聚集成片塊狀的頻率由0%增加為22%暗示冷凍解凍步驟對冷凍細胞之細部損害,可藉螢光鏡檢來得知。

  兔卵的急速冷凍用保護劑為EGF70EG先以內含18%胎牛血清的mDPBS配製成40% EG 溶液。F70亦先以內含18%胎牛血清的mDPBS配製成18% F70溶液。再把40% EG 溶液和18% F70 溶液以容積比2:1把兩者混合成終冷凍保護溶液EGF4018

  兔卵被吸置入EGF4018冷凍溶液小滴中,隨之吸填入0.25ml麥管中,經封口粉把麥管中端封口後,暫時擺置於實驗桌面,待滿10分鐘時,就直接把麥管投入液態氮,完成急速冷凍步驟。

兔卵解凍

  解凍步驟亦採急速解凍方式,自液態氮桶取出冷凍麥管就立即投入20的水浴槽中,一分鐘後取出融解的麥管,以消毒過酒精棉和無塵拭紙先後試去麥管外層殘餘水份。以剪刀剪去有封口粉的封口端,經推捧把麥管內的解凍卵液推擠入1.0M蔗糖溶液中,靜置10分鐘後予以鏡檢,

 

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檢出透明帶保持完整的解凍卵,移置入含18%胎牛血清的mDPBS培養20分鐘後,再次鏡檢其中存活的解凍卵,外觀型態完整及其卵細胞型態呈現如新鮮者,視為存活卵。完整率為完整卵數佔冷凍卵數的百分比表示之。存活率以存活數佔冷凍卵數的百分比表示之。

解凍卵完整率和存活率

  共計11頭白色紐西蘭種母兔和4頭雷克斯種母兔摘除出卵巢,合計回收到濾泡內的卵數有225個。計有182個兔卵被急速冷凍、解凍後仍保有完整透明帶,其完整率平均和標準偏差為82.0±20.2%存活率為77.5±20.3%兔卵冷凍解凍後之完整率和存活率似不受回收卵數多少而有明顯的改變。完整率自40100%不等,存活率亦0自至100%不等。但若以存活數佔有整卵數的百分比來看,則有94.7%(144/152)暗示急速冷凍步驟對透明帶之冷凍損傷大於對卵細胞型態。

  兔種比較時,紐西蘭白兔平均可回收18.5個卵,而雷克斯為5.3個卵。因個體間差異大,致標準機差亦大。當以相同的EGF4018冷凍液來急速冷凍兩兔種的卵,其完整率紐西蘭白兔為78.3±5.9%略少於雷克斯兔的93.7±9.8%,然並不顯著(P>0.20)卵存活率分別為76.1±6.3%81.2±10.4% (P>0.68)因此,卵的遺傳背景是否影響到兔卵急速冷凍效益,初步認為兩品種間差異並不重要,但個體間的差異則宜進一步探討其原因。

解凍後完整的兔卵大小量測值

  存活卵大小量測,有卵之直徑和透明帶厚度。卵之直徑扣除兩側外圍的透明帶厚度,即為卵細胞之直徑。解凍後仍保有完整透明帶的152個卵中,有148個卵直徑和透明帶厚度經量測後,以卵直徑大小自100175um予以計算其分佈頻率,卵直徑為150um者有16.22%其次有10.81%145um10.14%155um卵直徑為145um和以上者共計有91個,約佔61.5%(91/148)這些卵的透明帶厚度皆有18um厚以上。解凍後完整的兔卵大小和其透明帶似有相關性,經分析其表型相關係數為0.50(P<0.0001)。卵直徑平均和標準差為145.6±16.2um而透明帶厚度為18.5±2.7um

存活卵之螢光染色與粒線體分佈等級

  卵細胞質裡粒線體分佈可利用活性螢光染色劑Rhodamine 123R-8044, Sigma, St. Louis, MO, USA)來螢光檢測。Rhodamine 123溶液是以內含4 ug/ml牛血清蛋白但不添加酚紅的mDPBS來調製而成30 ug/ml濃度的螢光染液。存活活卵被吸置入螢光染液小滴中,就被放置於37的二

 

 

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氧化碳培養箱,經30分鐘後以含18%胎牛血清的mDPBS洗滌三次,藉以清除殘餘的螢光劑。事先在載玻片上以凡士林點上四角落小滴,四小滴凡士林的位置如同蓋玻片四角之大小,即可將已清洗過的染色卵置於四小點凡士林之中央,再輕蓋上蓋玻片。螢光染色的活卵於具備BP 450~490 nm, LP 515 nm的螢光顯微鏡Zeiss, Germany來鏡檢,其螢光染色後粒線體分佈等級乃參照豬卵急速冷凍報告(Wu and Lee, 1996)而定之。螢光染色的兔卵以ASA 400負片照相。新鮮兔卵之螢光染色後的粒線體分佈相是為解凍存活卵的完全存活之生化指標。

cgcp74.jpg (22955 個位元組)

兔卵解凍後之粒線體分佈等級。(1)均勻分佈;(2)次均勻分佈;
(3)粉圓狀聚集;(4)油滴狀散佈;(5)蜂巢式孔洞;(6)片塊狀。

 

 

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  新鮮兔卵經螢光染色後之粒線體分佈相,呈現極為均勻分佈的粒線體顆粒染色。兔卵經急速冷凍後,再解凍而呈現存活型態的兔卵107個經染色後,可概分為六等級。第一級呈現如新鮮卵螢光均勻分佈相;第二級者呈現均勻分佈相但有濃稀不均,是為次均勻分佈相;第三級者則有粉圓狀顆粒聚集;第四級者似呈現油滴狀散佈,略為有些洞出現;第五級則呈現如蜂巢式的孔洞;以及第六級者的嚴重聚隻成片塊狀。第四級卵被施壓使之破裂,其螢光染色的粒線體顆粒溢流而出,但其殘留在內的粒線體顆粒則似乎緊緊地環繞在細胞膜層,此似乎暗示卵細胞的微細結構在近細胞膜處較為結實密接,故卵細胞破裂時,其仍殘留在內。因此,進一步以高解析倍數來確知其粒線體和其他胞器間的結構差異,將有助於卵體外培養和顯微操縱技術之研發。

  在148個量測透明帶厚度的存活卵中,挑選其中107個紐西蘭白兔種的存活卵,其螢光染色後依上述的六等級評分,僅有2.8%的存活卵仍具有如新鮮卵般有均勻分佈的螢光,屬於第一級卵。若就此認為急速冷凍的兔卵經解凍後仍需具有其冷凍前應有的微細結構,則這種冷凍解凍步驟,已可有2.8%卵是完全受到冷凍損傷的完好卵。藉助螢光染色來看冷凍解凍步驟對解凍存活兔卵內粒線體分佈之影響,呈現外觀型態完整以外的微細結構變化,尤其粒線體分佈呈現次均勻、粉圓狀聚集、油滴狀散佈、蜂巢式孔洞和片塊狀等五級,依序有11.223.4 14.022.426.2%的存活卵之情況。若根據Noto et al. (1993)在人卵和冷凍研究結果,粒線體顆粒若聚集成雪花片狀則無法進一步發育。那麼,存活兔卵呈現第四至六級的粒線體分佈者,約有62.6%的存活卵將無法進一步發育。故應可先撿出螢光等級第一至三級的存活卵,再進行體外培養和受精。

卵大小與粒線體分佈等級之相關

  在107個存活的紐西蘭白兔卵,其卵直徑平均與標準偏差為145.2±17.1 um透明帶厚度為18.5±2.8 um以及卵細胞直徑為108.0±14.9 um粒線體分佈等級評分為4.2±1.4兔卵的粒線體分佈等級評分與卵直徑、透明帶厚度和卵細胞直徑分別均呈-0.21(P<0.02)-0.14(P>0.14)-0.19 (P<0.04)的負相關,亦即卵愈大其粒線體分佈等級被評為第一級的機率愈多;而卵愈小,則被評為第六級的機率多。由於透明帶厚度與線體分佈等級評分雖有負相關但不顯著,暗示粒線體分佈等級評分和卵成熟度有關。因卵愈成熟,通常卵直徑會增大之通則,則兔卵之急速冷凍方式需進行卵成熟期差異性研究,以之建立不同期兔卵之冷凍配方。

  卵直徑和卵細胞直徑呈0.94(P<0.001)的高度正相關,但卵直徑和透明帶厚度亦有0.52(P<0.001)的正相關。不過卵細胞直徑和透明帶厚度則

 

 

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僅有0.21(P<0.02)的正相關,暗示透明帶厚度並非卵大小的決定要素。

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