生殖細胞的冷凍　　　　　　　77　　　　　　　第三章　卵子銀行

參、豬卵巢的冷凍

　　豬卵巢的冷凍保存研究，為癌症病患接受藥物和放射線療程前或為保存其健康卵巢再植回體的機會，提供一項實驗動物模式。離體四至六小時的卵巢再保存於39℃恆溫培養箱、-20℃冰箱、或-196℃液態氮桶內，經24小時後再回收卵巢濾泡內的卵，其卵透明帶完整率均為100％，而卵丘細胞層包被完整率分別為70.3％(52/74)、63.3％(87/137)和20.4％(54/265)。卵在濾泡內被保存，不會因卵巢所保存的溫度而導致卵透明帶破損，但是卵透明帶外的卵丘細胞層會因冷凍而有片塊剝離情形。卵巢先浸泡於EGF4018或3M DMSO冷凍保護液10分鐘後再冷凍，當在常溫解凍時，卵丘細胞層包被在透明帶外仍完整的比率分別為28.8％和38.6％；而在70℃水浴槽內90秒解凍時，卵丘細胞層包被在透明帶外仍完整的比率分別為48.7％和37.9％。從EGF4018冷凍保護劑浸泡後冷凍的20個卵巢回收的卵經體外成熟培養48小時後，有10.9%（24/221）的卵存活，且經體外受精培養後能發育成四細胞胚。

豬卵巢移植的起步

　　Binns et al.(1969)曾把新鮮豬卵巢予以左右相互移植，有五頭母豬日後能產下5、6、7、11和3頭仔豬，仔豬出生體重平均為1.48±0.05 ㎏，證實豬卵巢經左右相互移植後，仍具有排卵功能。

卵巢冷凍的目的

　　卵巢冷凍保存是卵冷凍和胚冷凍的人工生殖操作項目之延續。年青女性癌症病患接受藥物和放射線療程前，若能把健康的卵巢組織先離體冷凍保存，待其恢復健康狀態後，再把卵巢組織解凍移植回體或直接進行卵母細胞的體外成熟，使年青的病患能在日後擁有自身遺傳的後代(Carroll, 1996; Wood et al., 1997)。意外傷亡的女性或保育類哺乳動物，其死後的卵巢先行冷凍保存，待代孕母體尋得時，亦可進行卵母細胞的體外成熟和受精移置等人工生殖操作，使該遺傳資源能被延續。

　　根據Green et al. (1956)進行卵巢組織冷凍觀察，發現有5％的卵是存活的，其中以始基濾泡(Primordial follicles)在冷凍後存活的機率最大。透過Deanesly(1954, 1956)、Parkes(1958)和Candy et al.(1995)的移植試驗，亦證實初級濾泡經冷凍後仍具發育能力。生殖細胞數量在哺乳動物胎兒期或新生兒期達到最高，但性成熟期一來臨，其殘留在卵巢內的數量就開始大量減少(Baker, 1971)。若從種原保存觀點來看，保存幼年期，甚至於胎兒期的卵巢，將可大量保存卵母細胞，同時胎兒至幼年期間的卵巢亦較小，且僅有少量的基質組織和結締組織。Cox et al. (1996)將胎兒期小鼠

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卵巢予以慢速冷凍於DMSO中，保存於液態氮桶達一週後，再予以慢速解凍後移植在去卵巢的成鼠，使成鼠再度擁有動情週期和排卵能力。那麼，胎兒期卵巢移植後存活的機率將甚大，在老鼠(Harris and Eakin, 1949; Mangoushi, 1974, 1977)、小鼠(Russell and Douglass, 1945; Rumery and Blandeau, 1976; Carroll et al., 1990)、天竺鼠(Donovan and Peddie, 1973)、兔(Holyoke, 1956)、和人(Povlsen et al., 1974)已經得到證實。

整粒卵巢的冷凍保存

　　整粒卵巢的冷凍保存，則以鼠類的卵巢組織冷凍保存試驗最早，Parrott(1959, 1960)就應用甘油為冷凍保護劑，把鼠類卵巢凍存在液態氮，再移植回體，並因而有數個懷孕的個例。Harp et al. (1994) 證實小鼠卵巢經冷凍與移植後，其卵巢組織特性和內分泌能力均可恢復，並有動情週期和排卵能力。 近年來，冷凍卵巢的自體移植(Autologous Transplantation)試驗已有仔鼠誕生(Carroll et al., 1990; Carroll and Gosden, 1993; Gunasena et al., 1997b)。Cox et al. (1996)以小鼠胎兒期的卵巢進行冷凍試驗，發現胎兒期卵巢經慢速冷凍和急速解凍步驟，其移植到成鼠後的再排卵受孕率最高，因此建議解凍速率要愈快愈好。透過Deanesly (1954, 1956)、Parkes (1958)和Candy et al. (1995)的移植試驗，證實初級濾泡經冷凍後仍具發育能力。Lavoir et al. (1996) 以牛胎兒期卵巢的始基生殖細胞在雙甲基磺氧化物(DMSO)冷凍保護劑予以慢速冷凍，發現胎兒期卵巢的始基生殖細胞經慢速冷凍解凍步驟後，把解凍後的始基生殖細胞細胞核用來進行核轉置(Nuclear Transfer)到去核卵細胞，有31%的核轉置卵細胞可發育成二細胞胚，但未發育成囊胚。Cortvrindt et al.(1996)將小鼠的腔前濾泡分離出，並在DMSO冷凍保護劑予以慢速冷凍，解凍後的腔前濾泡有76％的濾泡仍具有完整的卵母細胞，經體外成熟培養12天後，表現出成熟卵應有的特性且可受精孕育成囊胚。　

　　Gosden et al.(1994)把綿羊卵巢切片冷凍保存於液態氮三個月後，再移植回原體，一頭母羊經正常的發情、配種、受孕而至產下一頭仔羊。Newton et al. (1996)把人卵巢切片冷凍於液態氮兩個月後，再把解凍切片移植於有嚴重綜合免疫缺乏症(SCID)小鼠的腎臟上皮，經18天後發現有濾泡成長。Gunasena et al. (1997a)以解凍的Dorsett品種綿羊卵巢切片進行異種移植(Xenogeneic Transplantation)到裸鼠(nu/nu Balb/C品系) ，發現有4/7的裸鼠有動情週期(4.6+0.6天) ，相似於正常小鼠的動情週期(4.3+0.6天)。

豬卵巢之取得

　　豬的卵巢取自加工廠屠宰的發身前女豬，約為6~7月齡。女豬經電昏、放血、清洗、剝腹後就摘取卵巢，卵巢放入含有抗生素的速保精溶液(中

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化製藥,台北)保溫。卵巢上的濾泡大小不一，多數的濾泡直徑均在7mm以下，而極少數是10mm以上的濾泡。把卵巢的濾泡以解剖刀刀尖刺破後，可回收其內的卵丘卵母細胞複合體(又名濾泡卵)。

螢光染色法鑑別細胞之存活

　　選用螢光染色劑SYBR-14 (Molecular Probes, Eugene, OR, 美國)和Propidium Iodide (PI)來染卵丘卵母細胞複合體。根據Garner and Johnson (1995)和駱等(1995)所述方法加以調整，於每毫升的20％FCS/PBS溶液中各加入20ul的SYBR-14和PI備用液。依照Wu and Luoh (1998)鑑別豬卵丘細胞是否存活的方法，把螢光染色劑SYBR-14和Prodidium Iodide (PI) 放入卵培養液而製成有螢光染劑的培養液，再把卵丘卵母細胞複合體放入有染色劑培養的小滴中，五分鐘後，就在可見光波長488 nm下檢視包被在卵透明帶外的卵丘細胞是否存活，呈綠螢光者是活的，呈黃螢光者是垂死的，而細胞膜有破損的細胞會呈紅螢光者是死的。當在可見光波長546 nm檢視，僅呈紅螢光者仍清晰可辨。卵丘卵母細胞複合體經去除卵丘細胞後，可在波長488nm下檢視卵母細胞的存活，呈現綠螢光者是活的，呈現黃螢光者是垂死的，在546 nm檢視時更可分辨死活，垂死的仍清晰可見。

豬卵母細胞在488nm波長螢光鏡檢，有七個呈現綠螢光
者是活的，而有三個呈現黃螢光者是垂死的。X100。

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不同液體對豬卵的冷凍保護效果

　　豬的卵巢(約為豬屠後四至六小時)經剪去粘附的組織後，以含有抗生素的速保精溶液洗滌三次後，依卵回收過程所在的液相，分成三組。第一組是以針吸出濾泡液和卵，把具有完整卵丘細胞層包被著的卵和其濾泡液，就直接裝填於冷凍用麥管內冷凍；第二組是濾泡刺破後回收的卵，先經以含20﹪胎牛血清的磷酸鹽緩衝液(20％ FCS)溶液洗滌三次後，就以20﹪FCS溶液為冷凍液，把卵丘細胞層包被完整的卵裝填在麥管才冷凍的；以及第三組是把浸泡在20﹪FCS溶液中具有完整卵丘細胞層的卵，再移置入EGF4018冷凍保護劑小滴中靜置10分鐘後，才裝填在麥管冷凍的。EGF4018冷凍保護劑是以40％Ethylene Glycol和18％ Ficoll 70兩種溶液的容積比2:1，混合而成的(Wu et al., 1996; Wu and Lee, 1996)。麥管解凍步驟依 Wu and Lee (1996)方式進行。三組的卵經解凍後，計算透明帶仍完整的比率並鏡檢有多少卵仍保有完整的卵丘細胞層包被在透明帶外。

　　把卵和濾泡液一併冷凍，其透明帶仍完整者有95.7%，而卵丘細胞層仍完整地包被在外者亦高達100%。當卵經20%FCS溶液洗滌後在以之為冷凍液時，其解凍後仍有完整透明帶者為89.7%。完整卵仍具完整卵丘細胞層者亦僅有73.1%。但當改換成EGF4018冷凍保護液來冷凍時，解凍後的卵仍保有完整透明帶和卵丘細胞包被完整率均達98.4％以上。三種液相對卵透明帶完整率之影響，差異不顯著(P>0.05)，但卵丘細胞包被完整性則因卵在20％FCS溶液被冷凍時，而顯著地減少。但以EGF4018冷凍保護劑凍存時，幾近百分之百的卵丘細胞仍呈綠螢光，顯示卵丘細胞的冷凍保護劑是無法以濾泡液自身來充當之，濾泡液不足於確保卵丘細胞的存活。

豬卵巢保存狀況對卵存活之影響

　　豬卵巢(約為豬屠後四至六小時)經去除卵巢的粘附組織後，以含有抗生素的速保精溶液洗滌三次後，此時分別把浸泡在速保精溶液中的5、5和10個卵巢保存於39℃恆溫培養箱、-20℃冰箱、或-196℃液態氮桶裡。恆溫箱和冰箱保存的卵巢均個別裝在有蓋的離心管。恆溫培養箱之保存狀況是做為動物野外死亡並在炎熱天暴曬的模擬環境。冰箱保存是做為短期性的長途運輸之需。液態氮桶保存是做為長期性保存用。經過一天後，再回收卵巢濾泡內的卵，檢視卵丘細胞和卵母細胞的存活性。冷凍卵巢的常溫解凍步驟是自保存瓶取出卵巢就直接投入室溫的培養液中解凍。培養液為含有20％ FCS。經五分鐘後，檢視卵巢的外觀和濾泡有無裂損狀況。　　

　　卵巢被保存在39℃、-20℃或-196℃保存溫度中，待回溫後收集的卵，仍有完整卵丘細胞層者分別為70.3、63.3和20.4％。審視卵丘細胞層不完

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整的卵，發現其卵丘細胞層呈現片塊狀剝離狀態，明顯地不同於新鮮卵。卵巢在39℃保存後再回收的卵則無綠螢光的卵丘細胞群包被著。卵巢在-20℃保存後再回收的卵，有10%綠螢光的卵丘細胞群仍包被著；而卵巢在-196℃保存後再回收的卵，有5%綠螢光的卵丘細胞群仍包被著。卵母細胞是回收自-20℃或-196℃保存的卵巢者，均呈現綠螢光，表示仍存活著。但自39℃保存的卵巢回收來的卵母細胞則無一呈現綠螢光。因此，卵巢的冷凍保護劑之研發是為確保卵丘卵母細胞複合體的包被完整性。

冷凍保護劑浸泡後的卵巢之冷凍

　　將離體一小時內的卵巢以含有抗生素的速保精溶液洗滌三次後，各五個卵巢分別置放於EGF4018、3M的雙甲基磺氧化物(DMSO)、和無浸泡液中10分鐘，再將卵巢夾出並直接投入有液態氮的離心管中冷凍，冷凍卵巢與離心管再撿放於液態氮桶內的懸吊式保存瓶保存一天。隔天將未浸泡在冷凍劑的卵巢自液態氮桶夾出並直接投入常溫狀態的20％ FCS解凍，再將解凍卵巢夾出解凍液，置放於另一含有20％FCS的培養皿去收集濾泡卵。有浸泡在　EGF 4018 和 DMSO 冷凍劑的卵巢自液態氮桶夾出並直接投入常溫狀態的 0.5 M 蔗糖溶液中五分鐘，再將解凍卵巢夾出解凍液，置放於另一含有 0.5 M 蔗糖溶液的培養皿去收集濾泡卵。另一批卵巢在同樣的三種冷凍處理方式，各有五個卵巢予以急速冷凍，但為增加卵巢解凍速率，故解凍步驟是冷凍卵巢連同冷凍用離心管一起先夾放入70℃水浴槽內90秒，再把解凍卵巢夾放於37℃狀態的 0.5 M 蔗糖溶液中三分鐘。未事先浸泡在冷凍劑的卵巢先連同冷凍用離心管一起先夾放入70℃水浴槽內90秒，再把解凍卵巢夾放於37℃狀態的 20% FCS 溶液中三分鐘。三種冷凍處理的卵巢濾泡卵在各自的解凍液中去回收與檢視。

　　離體一小時內的發身前女豬卵巢先浸泡於冷凍保護劑EGF4018或3M DMSO中10分鐘後，再直接投入液態氮保存，和未經浸泡的卵巢冷凍組所回收的卵透明帶仍完整者的比率，不因卵巢先浸泡於冷凍保護劑之有無而不同。不過，五個卵巢末先浸泡於冷凍保護劑就直接投入液態氮之解凍結果，其透明帶仍完整者的比率僅有87％，暗示卵巢個體的差異性可能存在。浸泡在EGF4018或3M DMSO冷凍保護劑後再冷凍的卵巢，其解凍後再回收的卵之卵丘細胞層仍完整包被著比率分別為28.8％和38.6％。當把冷凍卵巢連同冷凍保存時離心管一起夾放在70℃水浴槽，浸泡90秒後，再將卵巢夾放入37℃狀態的0.5M蔗糖溶液，經三分鐘後，從濾泡所回收的卵均具有完整的透明帶，同時完整透明帶的卵之外圍包被著的卵丘細胞層，亦顯著地較常溫解凍者為高(P<0.05)。未事先浸泡在冷凍保護劑液的卵巢冷凍組，其卵丘細胞層包被完整比率有41.7％；而在EGF4018或DMSO冷凍液中予以冷凍者，其卵丘細胞層包被完整率亦分別為48.7％

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和37.9％。高溫解凍方式顯然較常溫解凍方式有較佳的卵完整率和卵丘細胞層包被完整率，同時卵巢解凍後的外觀比較上，高溫解凍的卵巢仍具有光滑緊密的外表。

從冷凍卵巢回收的卵之體外培養

　　將離體一小時內的發身前女豬卵巢經剪去粘附的組織後，以含有抗生素的速保精溶液洗滌三次後，就將五個卵巢直接投入有液態氮的離心管中予以急速冷凍。三十分鐘後再解凍卵巢，回收濾泡內的卵，檢視卵存活狀況。另計有30個卵巢直接投入液態氮保存瓶，再置放入液態氮桶內，保存35天後再予以解凍，卵巢自液態氮桶夾出並直接投入常溫狀態的20％ FCS解凍，再將解凍卵巢夾出解凍液，置放於另一含有20％FCS的培養皿去收集濾泡卵。先鏡檢濾泡卵透明帶是否有破裂，再檢視包被在卵透明帶外的卵丘細胞層是否完整。透明帶完整的卵則置於體外成熟培養小滴中，於39℃恆溫培養箱培養48小時。卵體外成熟的步驟參照 Wu et al. (1991a,b)研究方法進行之。培養液組成分是以含有5％胎牛血清和50ug/ml的Sodium Pyruvate之Waymouth MB752/1 培養液，並加入生殖內泌素LH、FSH和雌二醇(Cheng, 1985; Wu and Lee, 1998)。　

      將離體一小時的五個卵巢予以急速冷凍，三十分鐘後解凍卵巢，有69.8％(37/53)的卵仍具有80％綠螢光的卵丘細胞群包被著。將離體一小時的30個卵巢存放於液態氮桶35天後，取出並直接投入卵培養液中解凍，經五分鐘後檢視卵巢的外觀和濾泡有無破裂，有兩個卵巢是裂開的。自30個長期冷凍卵巢回收的522個解凍卵中，僅有21﹪(109/522）的卵仍有完好的卵丘細胞層包被著。解凍卵經螢光染劑SYBR-14和PI染色後，卵母細胞均呈現綠螢光，表示仍存活著。但再經體外成熟培養48小時後，僅剩3﹪（16/522）的卵細胞仍呈現綠螢光，且可完成體外受精步驟。

有冷凍保護劑浸泡的卵巢之回收卵體外培養

　　將離體一小時內的發身前女豬卵巢經剪去粘附的組織後，以含有抗生素的速保精溶液洗滌三次後，就將20個卵巢置放於EGF4018冷凍保護劑中浸泡10分鐘，再將卵巢夾出並直接投入有液態氮的離心管中冷凍，冷凍卵巢再撿放於液態氮桶內的懸吊式保存瓶保存一天。隔天再予以解凍，冷凍卵巢連同冷凍用離心管一起先夾放入70℃水浴槽內90秒，再把解凍卵巢夾放於37℃狀態的 0.5 M 蔗糖溶液中三分鐘。再將解凍卵巢夾出 0.5 M 蔗糖溶液置放於另一含有20％FCS的培養皿去收集濾泡卵。回收卵巢濾泡內的卵，透明帶完整的卵均予以體外培養48小時。

生殖細胞的冷凍　　　　　　　83　　　　　　　第三章　卵子銀行

　將離體一小時的20個卵巢存放於液態氮桶一天後解凍，經檢視卵巢的外觀並無破裂的濾泡。自20個解凍卵巢回收的221個解凍卵中，有43.4﹪(96/221）的卵仍有完好的卵丘細胞層包被著。解凍卵經螢光染劑SYBR-14和PI染色後，卵母細胞均呈現綠螢光，表示仍存活著。但再經體外成熟培養48小時後，僅剩10.9%（24/221）的卵細胞仍呈現綠螢光，不過有些卵核已呈現黃螢光。存活卵經體外受精6小時後與體外培養50小時後，有 2 個發育成四細胞胚。由於豬卵巢經冷凍後仍有完好的卵丘卵母細胞複合體，故值得進一步進行冷凍卵巢之移植試驗。豬卵巢浸泡在DMSO或EGF4018冷凍保護液，再冷凍之，回收的卵仍有完整卵丘細胞層包被者，增加至28.8~48.7％。從解凍卵巢的有腔濾泡所收集來的卵，卵的存活率雖低但可以體外成熟培養與受精。因此，改善豬卵巢的冷凍方式將可用來保存豬種原或用來做為建立癌症病患接受療程前保障其健康卵巢的一項實驗動物模式。

卵透明帶冷凍後有硬化現象

　　卵母細胞是一種巨大型細胞，因此在冷凍和解凍過程裡，忍受溫度的改變而不致於影響到其自身後續的發育和受精是冷凍研究的瓶頸。卵因冷凍和解凍而致使其細胞內在的微細胞器會產生異位現象，諸如細胞骨幹和分裂中的紡錘絲之移位、細胞質顆粒的移動和聚集、以及卵透明帶的硬化( Vincent and Johnson, 1992; George et al., 1994; Van Blerkom and Davis, 1994; Wu and Lee, 1996)。卵丘細胞的存在很明顯地會降低卵透明帶冷凍解凍後的硬化程度( Gianfortoni and Gulyas, 1985)。

卵丘細胞層凍後剝離

　　冷凍解凍過程中，卵丘細胞包被在卵透明帶的狀況，似有助於卵存活後的體外成熟和受精( Pellicer et al., 1988; Schroeder et al., 1990; Candy et al., 1994)。發身前女豬整粒卵巢直接丟入液態氮的急速冷凍後，環繞在卵透明帶外圍的卵丘細胞層呈現片塊狀剝離現象，而僅有20％左右的卵仍被卵丘細胞層完整地包被著，說明卵丘細胞和卵透明帶間之細胞結構性受到冷凍傷害。雖然這種卵丘細胞層片塊剝離現象，不會發生在事先將卵丘卵母細胞複合體自卵巢濾泡中收集並再經浸泡於EGF4018冷凍保護劑內的卵，因而可推測濾泡液並不是卵丘細胞包被完整性的最適冷凍保護劑。不過，將卵巢事先浸泡於冷凍保護液DMSO或EGF4018內10分鐘，再把卵巢直接投入液態氮內冷凍，其卵丘細胞包被在卵透明帶的比率明顯地較無冷凍保護劑浸泡卵巢者為高，說明卵巢的最適冷凍保護劑配方或浸泡時間是爾後可進一步研究的項目。

    生殖細胞的冷凍　　　　　　　84　　　　　　　第三章　卵子銀行

    Cox et al. (1996)以小鼠胎兒期的卵巢進行冷凍試驗，發現胎兒期卵巢經慢速冷凍和急速解凍步驟，其移植到成鼠後的再排卵受孕率最高，因此建議解凍速率要愈快愈好。本研究將卵巢在70℃解凍，已得到卵丘細胞層包被完整率為48.7％，此種減少卵丘細胞層剝離的可能原因，是解凍速率加速後其細胞內外冰晶無法形成，所以未造成細胞凍傷。解凍時如何減少冰晶現象的試驗，在 Mazur et al. (1972)和Shaw et al. (1995a,b)的冷凍鼠胚研究中已證實急速解凍可有效地減少細胞內冰晶數量。 Cox et al. (1996)明確地觀察到慢速解凍的卵巢，其外表層上皮細胞會因而受冰晶傷害，導致卵巢移植後較易發生組織粘連狀況，使輸卵管繖粘連在卵巢外表皮，而在排卵時無法收集成熟卵入輸卵管。因豬卵在濾泡液裡被裝填在人工麥管的冷凍結果，不會造成卵丘細胞層的剝離，故豬卵巢之急速冷凍和急速解凍速率可能是造成卵丘細胞層自透明帶剝離的主因，所以卵巢冷凍和解凍過程，濾泡壁細胞之抗凍功能或熱傳導速率是否不一，實值得探究之，以改善豬卵巢冷凍技術。　

　 Cortvrindt et al. (1996)把小鼠的腔前濾泡分離出，並在DMSO冷凍保護劑予以慢速冷凍，解凍後的腔前濾泡有76％的濾泡仍具有完整的卵母細胞，經體外成熟培養12天後，表現出成熟卵應有的特性且可受精孕育成囊胚。近年來，冷凍卵巢組織經解凍後，就在移植回原體前，先浸泡於膠原蛋白溶液或血漿凝塊中，發現有助於卵巢再排卵能力的表現，亦有仔鼠誕生(Carroll et al., 1990; Carroll and Gosden, 1993)。Gunasena et al. (1997b)以相似方法亦讓73%(8/11)的冷凍卵巢自體移植鼠能懷孕產仔，每窩有4.71+0.57頭(範圍2~10頭)，不論公母仔鼠長大後的產仔能力均如同對照組所生的仔鼠，長大後均產有8~16頭第二代仔鼠，顯然未受到上一代的冷凍卵巢自體移植之影響。Gosden (1992)指出初級濾泡之冷凍和移植試驗是一項保存胎兒至青春期哺乳動物生殖細胞的最佳方法，不僅因初級濾泡已位於卵巢皮層，且其代謝活動力尚低，同時易於接收鄰近組織的養分而能存活下來。Yen et al. (1996)利用膠原蛋白酵素溶液來收集各級豬濾泡，包括腔前濾泡和有腔濾泡，此項技術不僅可用來收集冷凍卵巢組織內大量各級濾泡，亦將可研究豬濾泡所受到的凍傷程度和不同級濾泡對其內卵母細胞的保護效果。因此，比較整粒卵巢或切片冷凍方式對其濾泡存活和再排卵的能力之影響試驗，是重視豬種原保存研究者可進一步探究的課題。

卵巢移植的潛在危害性

　　卵巢移植的潛在危害性亦需注意到，Shaw et al. (1996)把患有淋巴癌(Lymphoma)的小鼠卵巢組織切片移植到健康的小鼠，移植後9~43天就患有淋巴癌而死亡。

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