體外生產系統對牛胚胎發育之影響

( 家畜系/ 曲鳳翔 )

　　胚體外生產系統包括卵母細胞之體外成熟(In vitro maturation)、體外授精(In vitro feterlization)、體外培養(In vitro culture)，再將之移至代理孕母生殖道中，以孕育胎兒。此技術之建立不但可大量提供胚早期發育之基礎研究及基因轉殖與核轉置所須之胚源， 亦為胚生殖科技中之必備技術。雖然體外胚生產系統經過長時間的研究修正，但相較於體內生產者，仍有懷孕率低、胎兒存活率較低、胎兒過重、胎盤較大及懷孕母體與胎兒間訊息傳遞缺失等問題。因此，探討胚的成熟、受精、分裂、著床及分化發育作用是如何受這七天體外培養期間的影響而產生改變，將有助於建立更完善的體外培養系統。

　　除了不同的體外培養系統之外，影響胚發育的因素相當複雜，例如卵母細胞品質、精液製備方式、體外成熟受精環境、培養條件、胚移置技術及受胚母畜的差異均會影響胚的後續發育。體外培養依培養液成分及操作流程的不同可分為多種系統，目前廣泛被採用者為共培養(co-culture)方式，即利用卵丘細胞或輸卵管上及細胞於培養液中共培養，因共培養細胞代謝產生了許多不明物質及添加胎牛血清中所含未知生長促進因子，其中部分之有利成分能使牛胚能突破8~16細胞的發育阻滯期，於體外發育至囊胚期。此方法大大提升胚之產製效率，但因培養液中包含了許多未知的成分，所以又稱之為Undefined culture media 。為了釐清各種物質對胚發育的影響，較簡單的培養液常被運用於試驗設計中，例如僅於基本培養液中添加人工合成的輸卵管液、血清白蛋白等此類培養液成分簡單稱之為Fully-defined culture media 雖然大致上胚發育效果較差，但有助於對胚胎生理更進一步的研究探討。

　　在比較體外胚與體內胚型態上差異之研究中發現，體外胚之發育速度略為延遲，當發育至緊密化桑椹胚期時期結構亦較為鬆散。細胞質中亦含有較多的脂肪小滴，且其內細胞群(inner cell mass,ICM)，與滋葉細胞(trophoblast cell)間接合程度亦有不完整之現象。當培養液中血清濃度過高(10%以上)時，更有細胞碎裂情況之發生。進一步若探討其超顯微結構發現，經體外培養所發育之囊胚，其粒腺體的數量遠少於正常體內胚者。

　　此外，若利用不含血清之培養液進行培養時，該脂肪小滴堆積之情況將被明顯減少。因此，學者認為體外胚於發育過程中細胞內脂肪小滴過度的形成可能導因於過量吸收培養液中之營養分，加上粒腺體對細胞內脂肪無法正常代謝所致。在胚冷凍之研究也指出，經過冷凍-解凍後體外胚之受損情形也較體內胚者嚴重。這些訊息說明，體外生產胚之發育潛能較體內生產者，仍有不同程度之缺陷。比較胚移置後胚的發育情況顯示，於胚移置後第十天，源自體外生產胚所發育胎兒肢體長約為源自體內生產者之二倍，且於懷孕兩百天時體外胚所產胎兒之平均體重較體內胚者高出約17~19%，並發現這些胎兒的骨架發育速度更甚於其他組織，結果造成巨嬰症(large offspring syndrome,LOS)而易導致分娩時之難產發生，及出生後仔畜體體能耗弱、適應力差等徵狀。

　　上述現象同樣常發生於經由核轉置技術所產黌之複製動物。造成巨嬰症現象之原因，可能與胎盤結構異常，胚基因表晛失調有直接相關。影響牛胚著床後發育之因素，尚有許多未明之處；在探討豬胚發育能力的研究中明確指出，生殖道內動情素之濃度對豬胎之生長扮演重要角色，生殖道內動情素之分泌量與生長子(insulin-like growth factor-1 ,IGF-1)之表現呈現正回饋(positive feedback)關係，並伴隨胎兒發育之進展而漸升，惟此現象並未呈現於牛胎之發育過程；反之，生殖道內助孕素之濃度對牛胎發育之影響更甚於動情素者。研究顯示，助孕素促進早期牛胚之分裂與增生，於懷孕期更有促進胎兒生長與肌肉發育之能力。 此外，分析體外胚所生產第70天牛胎之肝臟細胞，發現其內所表現IGF-Ⅱ基因之mRNA量明顯較體內胚所生產者高，究其因，可能發生在胚於體外培養期間受到培養液中某些激素及未知生長促進因子之誘發。

　　綜觀體外胚於早期發育階段以迄胚著床後至分娩期間所呈現各項異常現象之事實，顯見雖短短七天之體外培養過程，卻影響後續長達數月之胎兒發育。這說明，胚體外環境之人工模擬，仍與母體生殖道所提供之自然生理環境有相當大的差距，足見胚體外培養技術仍有改善之空間，並鑒於體外培養技術為胚基因操作與胚基礎生理研究所必備之科技，因此藉由體外胚與體內胚生長發育差異性之探討，藉以尋求問題癥結所在，作為修正之指標，將是改善胚體外培養效率及胚生理研究之有效方法。