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生 乳 微 生 物     檢 測 晶 片

◆晶宇公司 滕涵菁 李泔泓 何若澐 吳佩樺

  影響乳牛產業競爭力之因素包括生乳品質、產量、飼養管理、銷售價格。在一定之飼養管理條件下,每頭乳牛在泌乳期的產量與其生乳品質是決定產業營運非常重要的因素,由於目前主要以體細胞數作為生乳的計價標準,直接反應生乳價格與酪農者的收入。若高體細胞數牛隻佔乳牛群多數,更顯示飼養管理品質不佳,缺乏產業競爭力。

看不見的損失

  牛乳房炎為乳房組織受細菌的、化學的、溫度的或機械的傷害而發炎的反應。乳牛體內為撲滅或中和此刺激、修補組織損害以及使乳房功能恢復正常,使得血中白血球數量增加,乳房組織因感染而造成大量體細胞剝落,導致的乳中體細胞數急遽增加。一般而言,因細菌感染造成的乳房炎最為常見,但若治療不當或拖延過久,可能引發其他病源菌感染,例如黴菌與黴漿菌等,難以治癒。許多牛隻雖經乾乳期治療,其乳產量通常無法恢復如前,且往往容易再次發生乳房炎。

  乳房炎已是大家公認最花錢的乳牛疾病,由於我國地處熱帶-亞熱帶,使得患有乳房炎之牛隻往往佔有整個牛群的比例相當高,約1/3 至 1/4。乳房炎亦會造成生乳產量降低與體細胞數上升,影響生乳品質與計價。研究指出,乳房炎的花費約佔乳牛所有疾病支出的 26%,而因乳房炎而導致的損失為牛隻不育及繁殖障礙等損失的兩倍。美國的國家乳房炎委員會(National Mastitis Council, USA),估計於美國每年因乳房炎所致的乳產量損失超過 10 億美金(相當於350億台幣),再加上其他衍生的損失則約20 億美金(相當於700億台幣),此機構又將損失金額以下列主要五個部份來估算,分別為乳產量降低、生乳因無法作為鮮乳生產材料之直接損失、乳房炎乳之廢棄處理費用、藥物材料與獸醫師診斷與治療服務以及乳牛淘汰損失等計算,經換算分析後,估計每頭牛每年因乳房炎的產業損失約180 元美金 (相當於台幣6300元)。

  美國國家乳房炎委員會所評估的這些損失並不包括因乳房炎直接或間接影響乳牛業的損失,這些看不見的損失例如乳品加工費用,減少乳製品的營養價值,因習慣性的濫用抗生素濫用造成乳中殘留,增加投藥的成本,降低乳牛場的聲譽,影響乳牛群的育種改進等。

  如何降低因乳房炎所造成之損失,必須從根本上預防,利用先進技術為工具,定期監控導致乳房炎的主要根源—細菌性病源菌,即在其低濃度且尚未明顯破壞乳牛泌乳組織時能夠早期發現,進行分別搾乳、避免因混入總乳而降低品質,另外,施行隔離、觀察與治療等必要措施,使得損失降至最低。

單一種乳房炎細菌種類的鑑定方法

  傳統的細菌性乳房炎乃利用培養基鑑定方法,通常需要2天以上時間 (表一),若根據中央標準局所公佈之檢測方法,每一種潛在或疑似的病源菌必須分別進行培養與鑑定,不僅所需培養基種類不同,必要時還得利用多種生化反應之結果組合才足夠進行菌種判定,這樣的工作依賴具有微生物鑑定之多年經驗者執行,非常耗時與繁雜。另外,對於臨床性乳房炎只能提供事後參考,延誤治療時機造成損失,無法改善產業之生產力。至目前為止,由於針對生乳中可能含有之傳染性鏈球菌類之檢測,尚未有商品化之產品,只有針對所有鏈球菌屬之菌種備有市售選擇性培養基,但無法確認其中是否含有傳染性的無乳鏈球菌,無法及時隔離並將潛在性乳房炎乳牛特殊管理,結果可能經牛群因進行搾乳時,由原本單一頭感染牛傳播至整個牛群,造成數倍損失。

如何利用生物晶片降低生產成本,提高產業競爭力

  目前以設計特異核酸引子 (specific primer) 進行聚合酵素連鎖反應 (PCR) 檢測微生物,非常普遍 ,例如大腸桿菌檢驗( Hsu and Tsen, 2001)。美國食品藥物管理局 (FDA) 所公佈之微生物檢測方法 (Bacteriological Analytical Manual, BAM)中,已有以特異核酸探針 (specific probe) 之方式分析 (Hill et al., 2001)。對於一般常見之病源性微生物,亦有上市商品,例如大腸桿菌、沙門氏菌、腸炎弧菌、金黃色葡萄球菌毒素基因檢驗 (TaKaRa Shuzo Co., LTD;GENE-TRAK System, USA),截至目前,罕有針對感染動物之病源檢測工具,對於細菌性乳房炎的防治並無助益,自行開發先進檢測工具,進行乳牛群監控,方能提高生產力與競爭力。

  我們在2001年酪農天地雜誌第45期第43至46頁以「生物晶片與農業科技」一文介紹生物晶片之基本特質、種類、基本製造原理,以及生物晶片在農業上實際應用於乳牛隱性遺傳疾病基因之育種晶片範例 。生物晶片是指運用分子生物學、分析化學、生化反應等原理進行設計,在玻璃、矽片、高分子合成物(例如塑膠)等材質上,結合生物醫學技術製成應用於生物化學分析的產品,其作用對象可以為基因、蛋白質或細胞組織等。生物晶片技術的主要特點是體積小、檢驗感度高、可獲得整體性(平行化)的實驗數據。

  每個生物或微生物(包括病毒)均以由不同的核酸(DNA或RNA)長列為遺傳物質,這些遺傳物質上的核酸序列具有「獨特」與「專一」兩大特性,在特定的條件下,唯有互補的核酸序列存在時,核酸分子間才能配對並形成穩定的雙股螺旋分子。研究指出,親源關係愈相近之物種其核酸序列相似程度愈高,若依照生物學上親源關係分類順序界、門、綱、目、科、屬、種來看,同一「種」生物間特異的核酸序列通常比同一「屬」生物高。這些遺傳物質我們利用這個生物特異(專一)序列的特質,製成互補序列核酸探針,利用核酸分子間能互補的結合的特性,開發微生物檢測晶片。

以高分子材質製作生物晶片

  尼龍纖維膜 (Nylon membrane)、玻璃與矽玻璃等是目前製作生物晶片常使用之材質,這些材質之選擇起源於研究機構進行實驗測試使用,但在製作生物晶片產品時及操作上卻有許多缺點。舉例來說,以尼龍纖維膜 (Nylon membrane)為生物晶片材質時,核酸雜交反應程序繁瑣且時間長達8-14小時,因材質柔軟使得操作者在使用時必須特別留心,此外,此類產品多仰賴進口,貨源無法自行掌控,無法降低成本。以玻璃與矽玻璃等為生物晶片材質時,在進行核酸雜交前必需先以化學物品進行表面處理與等待約5天的自然均質作用,耗時且費事。生物標的分子之使用亦必須以能被激發之螢光物質為主,無法持久,其成本為一般呈色用試劑2-5倍,此外,結果分析更需要昂貴儀器判讀,其價格約在3-4萬美元。

  晶宇生技公司是國內率先以高分子材質來製作生物晶片的生物晶片公司,經實驗測試比較,發現高分子材質生物晶片具有多項優於目前常使用材質之特點,例如無需化學前處理即能夠達到上述材質呈現之檢測功能、材料為國內生產取得容易、價格低、結構穩定、輕巧且操作便利,結果分析亦無需依賴儀器判讀。以民國89年所研發出的腸病毒檢測晶片 (DR. EVTM Chip) 為例,利用最先進分子生物技術,開發一6X6矩陣之生物晶片,即36組探針分佈於14x14mm的面積,可同時鑑定是否為一般腸病毒、腸病毒71型或克沙奇A16型,檢測流程僅需6-8小時。以此範例充分顯示生物晶片的優點,即在於能夠同時從事多種目標之檢測,一組探針之實驗結果相當於過去一根試管反應結果,一片腸病毒檢測晶片提供相當於36根試管反應結果。我們依據已建立之生物晶片平台,跟畜產試驗所新竹分所進行技術交流,針對導致降低生乳生產之潛在乳房炎細菌為檢測目標,開發第一代的生乳微生物檢測晶片。

第一代的生乳微生物檢測晶片

  我們彙整有關乳牛細菌性乳房炎報導,第一代的生乳微生物檢測晶片以下列常見造成乳房炎之細菌為檢測目標,包括二種傳染性乳房炎菌種,即無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) 及金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 為主,並加入四種主要的環境性乳房炎菌種,除包括牛鏈球菌 (Streptococcus bovis)、乳房鏈球菌 (Streptococcus uberis)、異乳鏈球菌 (Streptococcus dysgalactiae) 及其他鏈球菌與大腸桿菌 ( E. coli)。

  圖一顯示生乳微生物檢測晶片的三個主要操作步驟,即乳樣前處理、聚合酵素連鎖反應(PCR)以及雜交反應與呈色判讀,約需6小時完成。以下將個別步驟作簡略說明:

  (步驟一) 乳樣微生物DNA萃取: 取定量一毫升生乳樣品中進行核酸萃取,因生乳樣品中可能含有影響核酸萃取或後續核酸放大反應之物質,生乳樣品必需先經過離心與以緩衝液清洗,才能進行核酸萃取。萃取方法將以操作便利、所需材料費低且能快速處理大量樣品之原則所開發。

  (步驟二) 聚合酵素連鎖反應(PCR) :利用菌株的特異性核酸引子,該引子帶有Biotin之標定分子,經由設計與許多實驗測試之最佳條件進行,可將微生物特異核酸片段由少量擴增到可目視的DNA總量。

  (步驟三) 雜交反應與呈色判讀: 將上述之核酸放大反應之產物與微陣列型的生乳微生物晶片上核酸探針進行雜交反應,即置入50℃核酸雜合烘箱中反應1小時,檢體中經放大的核酸會與晶片上具有互補序列之探針產生專一性結合,再經過不同的嚴苛度洗滌,將未雜合或非專一性雜合之核酸片段去除後,以酵素呈色法可呈現雜合之結果。雜合成功的核酸分子,會在晶片表面產生紫藍黑色沈澱。圖二列出晶片上各菌種特異的核酸探針點的位置 (A),依據特異的呈色結果可判斷菌株種類 (B)。若單一菌種之特異核酸探針點呈現顏色反應,則表示該細菌種類非常可能存在於乳房組織或經由搾乳系統所得。但若在多種菌株感染時,則晶片上則會呈現多處特異核酸探針點的呈色反應,以此類推。

  我們利用單一晶片可同時進行多種乳房炎之細菌檢測 (表一),在6小時內可完成檢測工作與結果讀取,以檢測所需時間而言,遠遠優於耗時的傳統培養法。另外,在短短時間內,可同時獲得多方面資訊,得知是否為單一頭牛帶有傳染性乳房炎細菌,或可能為環境污染例如水源等造成乳房炎細菌分佈於牛群。

  未來可依照實際情況需求,增加同時檢測之菌種項目,包括與臨床乳房炎高度相關的黴菌和牛棒狀菌及其他病源菌或與危害食品安全之沙門氏菌種。目前晶片分析配合中華民國乳業發展協會的DHI之採樣系統,使得單一採得之生乳樣品平行進行潛在性乳房炎細菌種類之分析,並由畜產試驗所新竹分所及育種系主辦的台灣的畜產種原資訊網球(www.angrin.tlri.gov.tw)把晶片檢測結果與DHI資料庫整合,將檢測結果彙整於DHI網際網路系統,確切分析與菌株種類與體細胞數之相關性,並可觀察臨床乳房炎發生之頻率,提供酪農戶更多資訊以利提高生乳品質。

表一、生乳微生物之傳統與生物晶片檢測方法

圖一、生乳微生物檢測晶片之操作步驟與所需時間。

   (A) 生乳微生物檢驗晶片之核酸探針種類、數量與位置示意圖

   (B) 晶片檢測結果與微生物菌種判讀圖像

圖二、生乳微生物檢驗晶片晶片規格與結果讀取。傳染性乳房炎菌種以紅色字體顯示。