羊乳中牛乳摻假之快速檢測

專一性抗體的製備與純化

本文作者：胡智柏　陳秀雯　丁懷謙
(均任職於食品工業發展研究所食品科學組)

壹、摘要

　　利用蛋白等電點沈澱原理，自牛乳中分離純化酪蛋白作為抗原，用以免疫兔子及山羊。經過數個月追蹤及免疫後，兔子及山羊之血清中抗體力價已達105以上。免疫兔子經大量抽血並收集其血清後，以硫酸銨沈澱血清白質，並先後經DEAE-Sephacel陰離子交換管柱純化及連結有山羊酪蛋白之CNBr-activated Sepharose 4B親合性管柱純化出對牛乳酪蛋白具高專一性之抗體。此純化抗體經由間接型酵素連結吸附免疫分析法(indirect ELISA)檢測，結果顯示該抗體對牛乳酪蛋白之專一性及反應力，具有可偵測羊乳中2.5％牛乳摻入量之檢測能力，亦即此純化抗體可適用於indirect ELISA分析法之檢測方式，區分牛、羊乳酪蛋白。為提高抗體之專一性及商業化生產之便利，另外亦進行單株抗體之製備工作。目前已完成細胞融合之工作，初步篩選到10株對牛乳酪蛋白反應力較強的融合瘤細胞株。

貳、前言

　　近來羊乳逐漸受到消費者的注意與青睞，尤其業者更以本草綱目所記載的「羊乳性甘溫，補寒冷虛乏，療虛勞益精氣且補腎肺」等功效來廣告，因此國內消費者視羊乳為一種滋補品，價格遠高於牛乳。羊乳比牛乳易消化與吸收，適合嬰兒及體質虛弱者飲用，對牛乳過敏或乳糖不適者，更建議以羊乳取代。

　　但是羊乳與牛乳在外觀、化學組成上極為相似，再加上兩者價格差異頗大，便有不肖業者在經濟考量下昧著商業道德將牛乳摻入羊乳中魚目混珠來降低成本，侵害消費者權益，違反商品標示法、消費者保護法及公平交易法。另一方面，也可能導致對牛乳過敏者在不知的情況下誤飲，而發生過敏反應，危害消費者健康與安全，造成公共衛生問題。

　　目前已有多種檢測羊乳品中是否摻入牛乳的方法，主要是利用羊、牛乳中特殊蛋白質或脂質之成分差異作比對。在非免疫學方法中，有利用氣相層析儀分析脂肪酸組成比例(Iverson and Sheppard, 1989) ，但此方法並不適用於脫脂乳品之檢測，且靈敏度並不高，僅能偵測到10％左右的牛乳摻假量。也有利用分析特定蛋白質含量來做摻假之檢測，如高效能液相層析法、膠體電泳法、等電焦集法(isoelectric focusing, IEF)等方式；但是這些方法成本太高、耗時且需要專業人員操作，並不適用於乳品工廠的日常檢測。免疫分析方法是最常被用於乳品中種源辨別與分析的方法，包括洋菜膠免疫擴散法(agar-gel immunodiffusion) 、火箭免疫電泳法(rocket immunoelectrophoresis) 、血球凝集抑制法 (inhibition of haemagglutination) 、免疫墨點法(immunodotting)以及酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，其中以ELISA最廣為應用。

　　免疫分析方法是利用抗原和抗體專一性結合的特性，所發展出來的檢測方法。依所檢測的抗原種類，可將現有的羊乳摻假免疫檢測方法分為兩類，一類為檢測酪蛋白，另一類為檢測乳清蛋白。酪蛋白之抗原性(immunogenicity)較弱，而且容易受蛋白質水解酵素的作用而分解，但不易因受熱變性而改變其抗原性質；乳清蛋白之抗原性強，不易受蛋白質水解酵素所分解，但是在高溫加熱後會變性(Ramos and Juarez, 1984)。

　　使用酪蛋白為抗原的部分又可細分為使用全酪蛋白(whole casein)的(Aranda et al., 1988; Rodriguez et al.., 1990, 1993)，和使用β酪蛋白(Anguita et al.., 1996)的。但是這些蛋白質皆為羊、牛乳共有的，具有相當高的同源性與相似性，因此由這些抗原所產生出來的多株抗體，其專一性普遍都不好，偽陽性(false positive)偏高。為了克服此一難題，Rodriguez等人(1990, 1991, 1993, 1995)先後發展出兩種提高多株抗體專一性以及避免交叉反應(cross reaction)的抗體處理技術。其一是利用分別接有羊乳全酪蛋白和牛乳全酪蛋白的二種親和性管柱(affinity column) ，先將會和羊乳酪蛋白產生交叉反應的抗體去除，再將可和牛乳酪蛋白反應的抗體純化出來，如此便可得到對牛乳酪蛋白具專一性的多株抗體。另一是利用抗體修飾技術(rendering) ，將抗牛乳酪蛋白的多株抗體和羊乳酪蛋白混合，於37℃培養2hr，如此則可將會和羊乳酪蛋白產生交叉反應的抗體堵住(blocking) ，去除非專一的抗體而得到具有種源專一性(speciesspecific)的抗體。此外，抗體修飾技術的另一項優點是可減少各批多株抗體間之變異程度。

　　除了事後對所生產的抗體進行處理以減少交叉反應之外，選擇適合的抗體產生動物品種，也能事先降低非專一性抗體的生成。Garcia等人(1989)以牛乳乳清蛋白分別免疫山羊及兔子，以免疫擴散法檢測所產生多株抗體的專一性。發現由山羊所得到的多株抗體不會和山羊乳或綿羊乳的酪蛋白產生反應，具有高度的專一性；相反地，兔子所生產的多株抗體則對山羊、綿羊乳的酪蛋白有交叉反應產生。此種方法應用了免疫學的理論，即生物體在正常狀態下不會對其自身原有的蛋白質起免疫反應而製造出抗體。所以利用山羊作為多株抗體的生產動物來源時，產生對山羊乳酪蛋白有交叉反應的抗體的機率應該較低。

　　近年來由於單株抗體(monoclonal antibodies)製備技術成熟，多位研究人員便以此技術生產抗(牛)β酪蛋白(Anguita et al.., 1996)及抗β乳球蛋白(Levieux, 1994)的單株抗體，用於羊乳品中牛乳摻假的免疫檢測。單株抗體的優點是抗體具有高度專一性，無須再經親合性管柱純化或抗體修飾等繁雜過程，而且每批抗體都能保持一定的品質；其缺點是篩選產生高專一性、高靈敏度單株抗體之融合瘤細胞株的工作相當耗時且成本高。

　　考量本計畫目標在於研發適用於乳品工廠或集乳場現場操作之快速檢測試劑，因而選用熱安定之牛乳酪蛋白為偵測抗原，利用此抗原製備多株抗體及單株抗體，期能用於開發羊乳中牛乳摻假之快速檢測試劑。

參、材料與方法

材料：
　　牛乳、山羊乳得自台灣大學實驗農場。小鼠骨髓瘤細胞株NS-1來自食品工業發展研究所菌種保存及研究中心。BALB/c小鼠購自台大動物中心。細胞培養使用之RPMI 1640 (31800-022) 、FBS (fetal bovine serum, 261400-079)及D-PBS(Dulbecco's phosphate buffered saline, 21600-010)購自GIBCO/BRL(Gaithersburg, MD, USA) 。細胞融合劑50％PEG(polyethylene glycol)1500(703641)及mouse interleukin-6(MIK-6, 1444581)購自Boehringer Mannheim Biochemicals(Mannehim, Germany)。抗生素(Antibiotic-Antimycotic-Amphotericin B, 100X, B22110)購自Atlanta Biologicals Inc.(Norcross, GA, USA)。ELISA反應使用之酵素基質TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)和H2O2購自Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.(Maryland, USA)。所使用之藕合劑(conjugate)包含goat anti-rabbit IgG-HRP(whole molecular)A-0545；robbit anti-goat IgG-HRP(whole molecular)A-5420；goat anti-mouse IgG(whole molecular)A-4416皆來自Sigma(St. Louis, MO, USA)。微滴盤、T-flask、刻度吸管等實驗塑膠製品採用Nunc公司的產品。其餘藥品皆為試藥級。

方法：

一、免疫抗原之製備

1. 牛乳全酪蛋白之分離純化

　　製備方法採用Rodriguez等人之方法(Rodriguez, et al., 1993)。首先取200mL純牛乳裝入250mL離心瓶，於4℃下離心(13,000xg 10min)去除脂肪，再將離心瓶置入37℃水浴中保溫30min後，以0.2N HCl調整pH至4.6，使酪蛋白沈澱。然後將離心瓶再置入37℃水浴中繼續保溫30min，再於4℃下以6,000xg離心30min，去除上清液。沈澱物以蒸餾水沈澱物沖洗後，再於4℃下以6,000xg離心10min，如此重複水洗三次，將沈澱物表面可能殘留的乳清蛋白去除乾淨。將此純化酪蛋白沈澱物以冷凍乾燥方式製成粉末，保存於-20℃冰箱中。

2. 牛乳αsl 酪蛋白之純化

　　將純度85％之αsl酪蛋白(Sigma C-6780)以Urea SDS-PAGE(12.5％acrylamide, 8M urea)進一步純化。將含αsl酪蛋白之膠體片段切下，以電析法(electro-elution)自膠體中溶析出來，使用之過濾膜通透分子量限制為12-15Kd(Rio-Rad, cat#165-2985) ，電析液為50mM NH4HCO3+0.1％SDS，使用之電流每管8mA，電析4hr，收集過濾膜上之蛋白質，以磷酸緩衝液透析過夜，保存於-20℃冰箱中待用，並以Urea SDS-PAGE檢測此純化蛋白的純度。

二、多株抗體之製備

1. 免疫紐西蘭白兔製備多株抗體

　　以0.1M carbonate buffer(pH9.6)將牛乳全酪蛋白之冷凍乾燥粉末溶解成10mg/mL之酪蛋白溶液。以5mL之塑膠針筒吸取2mL之酪蛋白溶液，再以另一支針筒吸取2mL之完全佐劑(Freund's complete adjuvant, Sigma F-5881) ，以三通管連接於兩針筒，利用兩針筒的交互推拉，充分混勻，作為免疫抗原溶液。

　　取混勻之免疫抗原溶液，於紐西蘭小白兔之背部，以皮下多點注射方式。注射3-5處，每隻兔子共注射1.5mL以免疫兔子。之後每隔4週追加注射，除將完全佐劑改換成不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant, Sigma, F-5506)之外，其餘試劑與用量同第一次免疫。於第二次免疫之後，即以indirect ELISA分析檢測抗血清之力價強度，當力價值超過105時，即可大量採血，間隔兩週採血一次，每次採血量以每隻兔子不超過50mL為原則。兔血採集後，置室溫1hr後，放入4℃，1hr後，再離心(2000xg，20min) ，取其上清液，即為抗血清。

2. 免疫山羊製備多株抗體

　　取4mL完全佐劑，加入4mL 12mg/mL之牛乳全酪蛋白溶液(溶於去離子水) ，混勻乳化之後，作為免疫抗原溶液。以肌肉注射(intramuscular injection)方式，於阿爾卑(Alpine)品種山羊大腿部位注射抗原溶液，每隻各注射2mL，之後每隔1週，改以不完全佐劑取代完全佐劑，同體積同抗原量進行免疫追加注射，連續免疫4個月，每月採取少量血液檢測抗血清之力價強度，利用indirect ELISA分析法分別檢測對牛乳全酪蛋白及山羊乳全酪蛋白的力價強度，待力價值上升至105以上時，即可進行大量採血。大量採血每次每隻300mL為限，每個月採血一次。將採集之血液於室溫靜置1hr後，離心(2000xg，20min)，取其上清液，即為抗血清。

3. 抗體(免疫球蛋白)之製備與純化

　　於4℃添加固體硫酸銨於抗血清至50％飽和度，於4℃下以11,000rpm離心15min，收集白色沈澱物，以少量的0.07M磷酸緩衝液(pH6.3)予以溶解，並以相同之緩衝液透析。透析之後，通入事先已經以磷酸緩衝液平衡之DEAE-Sepacel陰離子交換管柱中，以相同緩衝液流洗，同時以280nm波長之偵測器同步檢測流出液中蛋白質流出情形。收集第一個吸收峰(即不與陰離子交換管柱結合的物質) ，此即為免疫球蛋白G的區分(fraction)。將免疫球蛋白G的區分收集後，以超過濾膜(Amicon, YM-10)方式濃縮，再以生理磷酸緩衝液(PBS)透析，置-20℃冰箱中保存。取少量此純化抗體以indirect ELISA分析法分別檢測其對牛乳酪蛋白及羊乳酪蛋白之力價(titre)。

4. 親合性管柱之製備與抗體之進一步純化

　　依Pharmacia Fine Chemicals AB的使用說明，將6.6g CNBr-activated Sepharose 4B膠體粉末溶於100mL之1mM HCl中，靜置15min使膨脹後，以水流抽氣方式經Whatman No.5濾紙去除HCl，再以1mM HCl清洗。接著以總量為100mL之coupling buffer(0.1M NaHCO3+0.5M NaCl pH8.3)分數次清洗，然後將吸乾的Sepharose 4B自濾紙上刮下，加入含116.6mg山羊全酪蛋白之20mL上述coupling buffer中，以end-to-end(試管反覆顛倒)的混勻方式於室溫下反應2hr。反應完畢後以900rpm離心5min以去除coupling buffer，再以20mL coupling buffer以相同離心條件清洗一次，去除上清液，接著加入20mL blocking buffer(0.2M glycine，pH 8.0)於室溫下以end-to-end的方式反應2hr，再以coupling buffer清洗一次，接著以100mL含0.5N NaCl之0.1M醋酸緩衝液清洗，最後再以coupling buffer清洗五次，即可裝填管柱(Rodriguez et al., 1993)，製得一膠體體積約24mL，截面積2cm2，長度約12cm之親合性管柱。在純化抗體之前於4℃下以10倍管柱體積量之生理磷酸緩衝液以0.1mL/min之流速進行抗體之純化，同時以280nm波長之偵測器同步檢測流出液中蛋白質流出情形。收集由管柱流洗出來的物質，此即不會與山羊全酪蛋白結合之抗牛全酪蛋白抗體，亦即本實驗所欲使用之抗體；當流出液中不再有蛋白質出現後以0.05M triethanolamine(pH 11.5)溶液將結合於管柱上的物質(即會與山羊酪蛋白發生交叉反應之抗體與其他雜質)沖洗下來收集於另一玻璃瓶中。將先收集到的溶液(即未結合於管柱的物質)利用超過濾膜(Amicon, YM-10)濃縮再以生理磷酸緩衝液透析後保存於-20℃冰箱中。取少量經透析後之濃縮液分別進行對牛乳酪蛋白與對羊乳酪蛋白之力價檢測若前者之力價未超過後者之102倍以上時，則需再次進行親合性管柱純化。

三、單株抗體之初步製備

　　於細胞融合前2個月，開始免疫BABL/c小鼠(雄性，5-8週齡)。以生理食鹽水製備0.5mL 1 mg/mL之牛乳全酪蛋白，加入0.5mL完全佐劑，以震盪器充分混勻10min，以腹腔注射方式(intraperitoneally, IP) ，每隻小白鼠注射0.2mL；之後每隔一星期，實施免疫追加注射(抗原與佐劑使用量皆相同，但改用不完全佐劑) ，每週並自尾部抽取少量血液供力價檢測用。於細胞融合前一週開始培養NS-1細胞，使用的培養液為添加10％的胎牛血清(fetal calf serum)與1×抗生素之RPMI 1640。

　　進行細胞融合時，先將已免疫之小鼠以乙醚麻醉，取其脾臟，儘可能去除脾臟外圍的結締組織，在無菌狀況下以RPMI培養液沖洗數次，放置於不鏽鋼篩網(置於5mL之RPMI培養液中)上，以無菌玻璃杵研磨脾臟至無可見破碎組織，離心5min(1,300rpm) ，去除上清液，沈澱物再懸浮於10mL RPMI培養液中。將NS-1細胞與脾臟細胞混和，以1,300rpm離心5min，去除上清液，以手指輕敲管壁使細胞散開。接著於1min內將1mL50％PEG沿管壁加入管中，再於5min內將5mL含10％胎牛血清之RPMI培養液加入，接下來於1min內加入15mL含10％胎牛血清之RPMI培養液，將細胞充分混合，離心(700rpm，5min) ，去除上清液，所收集的細胞再懸浮於120mL融合細胞用的培養液(RPMI培養液內含20％胎牛血清、1×HAT、1×抗生素、100U/mL的IL-6以及來自3mL未經免疫白兔血清之紅血球溶液(作為feeder cell)中，分裝於無菌96孔細胞培養用微滴盤(每槽200μL) ，置於含5％二氧化碳之37℃培養箱中培養。

　　於培養期間每日密切觀察細胞生長情形，於3-5天後更新培養液以確保持養分充足。於細胞融合後約2週後，自每槽中吸取100μL，以indirect ELISA分析法檢測其中抗體力價高低。將力價較高的細胞吸取出來，移至24孔細胞培養用微滴盤中放大培養，待細胞量足夠即可以限數稀釋法(limiting dilution)進行單株化。計算細胞數，將細胞稀釋至分裝於96孔微滴盤後每槽含有約1∼10個細胞量的程度，再將此稀釋液分裝於96孔細胞培養用微滴盤中，置於37℃培養箱中培養。於培養期間視其生長情形，適時更新培養液。而於培養10天後，每槽取100μL細胞培養液以indirect ELISA分析法檢測其力價。挑選力價高的細胞，移至24孔細胞培養用微滴盤中大量培養，再進行一次單株化的工作(Freshney, 1994)。

四、間接型酵素連結免疫吸附分析法(indirect ELISA)之製備與操作

　　參照Rolland等人(1993)之方法，以0.1M carbonate buffer(pH9.6)溶解牛乳全酪蛋白或山羊乳全酪蛋白(10μg/mL) ，分裝96孔微滴盤 ，每槽100μL，37℃培養箱中培養1hr，利用微滴盤清洗機以PBST(10mM PBS+0.05％ Tween20)洗五次。接著於每槽中加入200μL之1％gelatin溶液，置於37℃中培養1hr，以PBST重複清洗五次，用力拍打微滴盤以盡量去除多餘液體，於室溫下倒置約3hr，封盤，置於4℃下儲存備用。在檢測力價時，將抗血清或細胞培養液檢體以PBST序列稀釋之後，將稀釋後的檢體加入微滴盤中，每槽中加入100μL，於37℃下培養1hr，以PBST清洗五次，接著加入以1％gelatin/10mM PBS稀釋10,000倍之耦合劑，每槽加入100μL(若為檢測兔子抗血清力價則採用goat anti-robbit IgG-HRP；山羊抗血清則採用rabbit anti-goat IgG-HRP；小鼠則使用goat anti-mouse IgG)，於37℃下培養1hr，以PBST清洗五次，然後每槽加入100μL之HRP酵素反應基質(TMBA液+TMB B液，1：1) ，於室溫下避光反應10min，每槽加入100μL之1M H3PO4終止反應，然後以Automated Microplate Reader EL 309(Bio-Tek Instrument, Inc., Winoski, VT, USA)測定450nm波長之吸光值。

　　力價是指經一系列稀釋後的檢體，其吸光值大於臨界直(critical value)時的最大稀釋度而以陰性對照組(未免疫前的抗血清)的三重覆測量平均值加上其兩倍標準偏差(standard deviation)作為臨界值。力價值越高，表示檢體中特定抗體之含量越高。

肆、結果與討論

　　生乳中的蛋白質可分為兩大類，一類為乳清蛋白，由乳球蛋白、乳白蛋白、免疫球蛋白等所組成；另一類為酪蛋白，由α、β、κ等酪蛋白所組成。乳清蛋白的抗原性較酪蛋白強，但是在乳品的滅菌過程中，容易因為加熱處理而被破壞變性，而酪蛋白雖然抗原性較弱，但在乳品加熱處理後，仍能保持活性。基於乳中以上兩類蛋白質生化特性之差異 ，學者建議若要以免疫方法檢測羊乳中是否摻有牛乳，應利用牛乳酪蛋白為偵測對象，方可將應用範圍擴大到經高溫滅菌處理(90℃，30min)或巴斯德殺菌處理(74℃，3-15秒鐘)的羊乳，而不侷限於生羊乳檢測(Amigo et al., 1991)。由於本計畫目的在發展適用於羊乳產品之快速檢測試劑，因此選定具熱安定性之牛乳酪蛋白作為偵測對象。

　　依等電點沈澱原理將酪蛋白自牛乳中純化出來，圖1為以Urea SDS-PAGE檢測此純化物純度之結果。由圖1並可看出牛乳酪蛋白和羊乳酪蛋白在電泳上的差異僅在αsl酪蛋白的泳動速率，此即為CNS公佈「羊乳中牛乳之檢出(CNS 14117 N6304)」(中國國家標準，1998)方法所依據的原理。

圖1：以Urea SDS-PAGE檢測各種抗原純度之電泳圖譜
Fig. 1 The Urea SDS-PAGE patterns of various purified antigens.

　　利用上述經純化之牛乳酪蛋白免疫紐西蘭白兔或山羊以製備多株抗體。表1為紐西蘭白兔在免疫處理後其抗血清力價(titre)變化情形。4隻兔子在免疫後24天以後對牛乳酪蛋白和羊乳酪蛋白的力價都在105以上，其中兔1以外的3隻兔子在86天以後，其力價差都縮減到約101範圍內，此一現象正如預期結果(Rodriguez et al., 1990, 1991, 1993) ，因為牛乳酪蛋白和羊乳酪蛋白具有相當高的同源性，僅有少數胺基酸的差異而已(Aranda et al., 1988)。

表1：免疫兔子抗血清之抗牛乳酪蛋白及羊乳酪蛋白力價在免疫處理後之變化
Table.1:Changes in titre of antisera from immunized rabbits against cow and goat whole caseins after immunization treatment.

　　為去除交叉反應，先由上述抗血清以DEAE-Sephacel陰離子交換管柱純化出免疫球蛋白G(IgG)，接著以羊乳酪蛋白親合性管柱做進一步純化，會與羊乳酪蛋白起交叉反應的抗體便結合在管柱中，而不會結合的便是對牛乳酪蛋白具高專一性，但不會與羊乳酪蛋白反應的抗體。純化結果如表2所示，表中的數值代表以indirect ELISA分析法檢測所得的450nm吸光值，此數值越高，表示其反應力越強，即該特定抗體的含量越高。經硫酸銨沈澱所得之免疫球蛋白溶液於105稀釋度時對牛乳酪蛋白與羊乳酪蛋白的反應值分別為0.515與0.355，兩者差異未超過兩倍。即使再經陰離子交換管柱純化後，於106稀釋度時對牛乳酪蛋白與羊乳酪蛋白的反應值(分別為1.278與0.992)差異也不大。然而，再經親合性管柱純化後，未與管柱上羊乳酪蛋白結合之抗體(於102稀釋度下)對牛乳酪蛋白與羊乳酪蛋白反應的吸光值分別為0.977和0.147，相差了達7倍左右。於103稀釋度下，差異更加顯著(分別為0.167及0.004) 。相較之下，會與親合性管柱結合之抗體對牛乳酪蛋白與羊乳酪蛋白反應的吸光值相近，於102稀釋度下分別為0.139和0.155。

表2：免疫兔子抗血清於硫酸銨沈澱、陰離子交換管柱與親合性管柱純化過程中，其抗體對牛乳酪蛋白與羊乳酪蛋白的專一性(以450nm吸光值表示)變化
Table.2:The changes in specificities(expressed in absorbance at 450nm)of rabbit antisera against bovine and goat whole caseins during(NH4)2SO4 precipitation, DEAE-anion exchange column and affinity column purification proceses.

　　以免疫學的觀點來看，一正常生物體不會對其自有蛋白質產生抗體，因此有Garcia等人(Garcia et al., 1989)成功的利用此原理，藉用山羊作為生產抗牛乳酪蛋白抗體的來源，以避免產生抗羊乳酪蛋白抗體的可能性，而獲得對牛乳酪蛋白具專一性的抗體。考量由兔子所能採得的血液量較少、專一性不高的情況下，另外於台大實驗農場先後購買了4隻山羊(Alpine品種，雌性)，以牛乳酪蛋白為抗原進行免疫，免疫處理後其抗血清之力價變化如表3。由表中可發現於免疫1個月以後其抗血清力價皆已達104以上。然若比較其對牛乳酪蛋白和羊乳酪蛋白的力價值，則可發現兩者之差距並不如預期的顯著。

　　推測其可能原因，是牛乳酪蛋白與羊乳酪蛋白之同質性太高，以 αsl酪蛋白為例，山羊乳酪蛋白和牛乳酪蛋白之氨基酸序列僅有少許差異，相較之下，綿羊乳αsl 酪蛋白和山羊乳、牛乳酪蛋白的差異則較大 ，以氨基酸140-149片段為例αsl，山羊乳與牛乳αsl酪蛋白僅有一個氨基酸 (第148氨基酸) 有差異，而綿羊乳酪蛋白則完全缺乏此片段( Brignon et al., 1989) ，因此支持上述論點的Rolland等人(1993) 成功地以此合成氨基酸片段免疫綿羊，而製備出能同時檢測牛乳及山羊乳之抗體。

　　除了以多株抗體作為檢測試劑的抗體來源之外，為了確保高專一性且品質穩定之抗體來源，同時進行單株抗體的製備。與製備多株抗體相同之處，單株抗體的免疫抗原也是採用牛乳酪蛋白，以腹腔注射方式免疫BABL/c小鼠，經免疫處理後其抗血清之力價變化情形如表4。由第一次的細胞融合初步篩選到10株生長良好的融合株，但因其抗體力價普遍都不很高(原倍細胞培養液之反應值A450約在0.4-0.6之間)。

　　未來工作將分三方面進行，一是以親合性管柱純化兔子及山羊抗血清，二是繼續篩選能產生高專一性、高力價單株抗體之細胞株，以進行單株抗體大量生產，三則是利用上述抗體進行各種免疫檢測試劑的開發，除了已發展出來的indirect ELISA分析法之外，希望能開發操作簡便、適用於乳品工廠或集乳場現場使用的快速檢測試劑。

表3：免疫山羊抗血清之抗牛乳酪蛋白及羊乳酪蛋白力價在免疫處理後之變化
Table.3:Changes in titre of antisera from immunized goats against cow and goat whole caseins after immunization treatment.

表4：免疫BABL/c小鼠之抗血清對牛乳酪蛋白及羊乳酪蛋白力價在免疫處理後之變化
Table 4:Changes in titre of antisera from immunized BABL/c mice against cow and goat whole caseins after immunization treatment.

　　本研究承蒙行政院農業委員會與中華民國養羊協會之經費補助(計畫名稱：羊乳中牛乳摻假之快速檢測，88科技─3.3─糧─01) ，並感謝國立台灣大學畜產學系之協助，特此致謝。