保種家畜禽遺傳資訊之鑑定與利用

計畫名稱及編號：保種家畜禽遺傳資訊之鑑定與利用

　　　　　　　　83 科技－2.3－牧－17（2）

機關名稱：台灣省畜產試驗所

執行人姓名：張秀鑾、葉素惠、吳明哲、林德育、劉瑞珍、李啟忠、黃志𡩋、

　　　　　　　黃耀興、李光復、謝瑞春、康清亮、邱作相、康獻仁

一、中文摘要：

　　本計畫之目的在建立台灣保種家畜禽之遺傳資訊，分別就保種族群進行血型分析，保種母族群之遺傳純度鑑別，種公、母畜禽細胞遺傳純度鑑定及遺傳歧異度之保存。本年度以本所保種之桃園豬、蘭嶼豬、黃牛、水牛、黑山羊、梅花鹿、水鹿、土雞、褐色菜鴨、黑色番鴨、中國鵝等家畜禽品種及中興大學保種之土雞族群，進行PGD和PHI遺傳型鑑定，PGD除桃園豬有雜合子外，其它保種家畜禽均為單一基因純合子。PHI在小耳豬、水鹿及褐色菜鴨有雜合子外，其它保種畜禽均為單一基因純合子。桃園豬、蘭嶼豬、水牛、黑山羊及褐色菜鴨的粒線體DNA片段型鑑定中，並未發現個體間差異，但以相同內切型限制酵素來分切不同種別性差異存在，其中以豬的樣品數較具族群代表。

二、研究計畫主題中（英）文關鍵字：

種原（Germplasm），家畜禽（Domestic Animals），遺傳標記（Genetic Marker）

三、前言：

　　本土性家畜禽曾是國內重要畜產業生產用品種，有其本土性產品風味，然在追求高經濟收益的衝擊下，逐漸因生長速率不如外來品種而被棄養，僅有土雞和菜鴨仍屬商業用品種但市場並非國際化，故整體上而言，這些本土性豬、牛、羊、雞、鴨、鵝和鹿品種仍被粗放式飼養，而擁有抗病性、耐粗性、耐熱性和特殊風味等美譽。為了保存其基因俾供瞭解和利用其特性於外來品種改良上，且進一步建立保種族群之遺傳資訊，將為國際上畜產種原保種和鑑定工作盡生態保育義務（吳等， 1990； Wu et al.，1991 ＆ 1992；張等，1993）。

　　種原保存與利用，自1980年始即普遍受到世界各國動物育種學家的重視。到1994年時，世界糧農組織針對家畜類中的豬、牛、水牛、山羊、綿羊、馬和驢等進行全球性調查，計有 2,719 個品種被利用中，然其中有 390 個品種瀕臨絕種危機（Loftus，1994）。種原基因的保存可用生殖細胞的冷凍保存方式，使精子、卵母細胞及胚等生殖細胞予以液態氮保存，但保存條件至為嚴謹，且需定期解凍觀察其活力。在遺傳資訊或基因保存，則以 DNA 的方式保存，日後利用各種分子生物學的技術來判別特殊基因序列組成，是針對此類珍貴基因之利用，預留基因交流的契機（張等，1993）。

四、試驗材料及方法：

(一)分別自本所、各分所場及中興大學之保種族群採取血液樣品，血球洗淨後冷凍保存，利用醋酸纖維膜電泳法，分析 PHI 及 PGD 之遺傳型（葉等，1994），其電泳條件如表1。

表1. 保種家畜禽ＰＨＩ和ＰＧＤ遺傳型鑑別電泳條件

保　種　動　物	電泳電壓(volt)		電泳液ｐＨ值		電泳時間(min)
保　種　動　物	PHI	PGD	PHI	PGD	PHI	PGD
桃　園　豬	320	320	8.7	7.4	25	20
蘭　嶼　豬	320	320	8.7	7.4	25	20
水　　　牛	320	320	8.7	7.4	25	20
黃　　　牛	320	320	8.7	7.4	25	20
黑　山　羊	320	320	8.7	7.4	25	20
梅　花　鹿	320	320	8.7	7.4	25	20
水　　　鹿	320	320	8.7	7.4	25	20
土　　　雞	200	200	9.0	7.4	40	20
褐色菜鴨	200	200	8.7	7.4	35	20
黑色番鴨	200	200	8.7	7.4	35	20
灰色中國鵝	200	200	9.0	7.4	40	20
白色中國鵝	200	200	9.0	7.4	40	20

(二)取保種動物之肝臟或肌肉進行粒線體 DNA 萃取及鑑定( 薛等，1993 ；劉與吳，1993；駱與吳，1993)。肝臟或腿部肌肉的粒線體去氧核糖核酸萃取純化過程中，不必經過氯化銫梯度法、超高速離心和重覆透析的繁瑣步驟。採集到20 公克左右的肝樣材或肌肉樣材浸泡於 50 毫升的 0.25 M 蔗糖溶液中攜回實驗室。粒線體去氧核糖核酸純化步驟簡列為三大步驟：

把新鮮或冷凍樣材在攝氏四度的冰水浴中，以 SEH 溶液來磨碎後，並經離心重力 900 和 15,000 的離心步驟，沉澱出粒線體顆粒。
加入蛋白水解酵素 K（10 微毫克／毫升的水解溶液，酸鹼值為 8.0 ）於攝氏52 度中消化掉粒線體膜的蛋白質，之後把 5M 的氯化鈉溶液滴入，並靜置在攝氏四度中三小時，使核糖核酸沉澱掉，就收集到粒線體去氧核糖核酸溶液。
應用一次的酚和氯仿溶液萃取粒線體去氧核糖核酸，把純化的粒線體去氧核糖核酸顆粒在 12,000 離心重力下沉澱出，並可經百分比七十的乙醇進一步純化之。純化後的粒線體去氧核糖核酸經過內切型限制酵素在攝氏三十七度水浴箱中作用一小時，就可在內含 0.9 ％的洋菜膠片上進行電泳分析，電泳液 TBE的酸鹼值為8.5，設定直流電壓一百伏特，經三十五分鐘的電泳，就把膠片浸泡於顯相液中二十分鐘，並在紫外光照射時呈現電泳帶。藉以鑑別有無粒線體DNA片段型。

五、結果與討論：

保種畜禽中，PHI測定中發現水鹿有 2 隻母鹿為 AB 型的雜合子個體，蘭嶼豬有4隻為 AB 型雜合子，褐色菜鴨其中 22 ％為AB型雜合子，其它各種畜禽均為純合子個體；而 PGD 在桃園豬有 AA、AB 及 BB 型，其它種畜禽均為純合子個體（表２及表３）。各保種家畜的 PGD 和 PHI 電泳後之位置比較如圖１所示，桃園豬、蘭嶼豬、水牛、黃牛和黑山羊 PGD 電泳的位置相當接近，但黃牛及土山羊 PGD 與血紅素的距離較桃園豬、蘭嶼豬與水牛 PGD 與血紅素的距離遠。梅花鹿及水鹿PGD與血紅素的距離為所有保種家畜中最接近。保種家畜的PHI桃園豬、蘭嶼豬、黑山羊及水鹿AB型之位置極為接近，但黑山羊PHI與紅血球的距離較近，水鹿最遠。而水牛、黃牛與梅花鹿PHI的位置相近，但水牛血紅素呈二條帶狀，黃牛血紅素與PHI間的距離較梅花鹿近。保種家禽PGD和PHI電泳後之位置比較如圖２所示，土雞PHI較其他家禽跑得慢，血紅素較接近陽極，其它保種家禽之PHI均較血紅素跑得快，褐色菜鴨與黑色番鴨血紅素位置相近，但黑色番鴨PHI較褐色菜鴨慢，中國鵝之血紅素略快於PHI，但有大部分重疊在一起。

表2. 保種家畜ＰＨＩ和ＰＧＤ遺傳型鑑別統計表

保種動物	桃園豬	蘭嶼豬	水　牛	黃　牛	黑山羊	梅花鹿	水　鹿
採血連絡人	林德育	李啟忠	黃志𡩋	李光復	謝瑞春黃耀興	康獻仁	康獻仁
血樣鑑定人	林德育	葉素惠	黃志𡩋	李光復	謝瑞春黃耀興	康獻仁	康獻仁
保種地點	新化總所	台東場	花蓮場	恆春分所	恆春分所花蓮場	高雄場	高雄場
已完成隻數	178	59	76	107	196	36	24
公	87	12	1	34	65	16	12
母	91	47	75	70	119	20	12
系譜不全	0	0	0	3	12	0	0
－－－－－－－－－－－－ＰＨＩ遺傳型分析－－－－－－－
AA	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	36 (100％)	22 (92％)
小計AB	0 (0％)	4 (7％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	2 (8％)
BB	178 (100％)	55 (93％)	76 (100％)	107 (100％)	196 (100％)	0 (0％)	0 (0％)
AA	0	0	0	0	0	16	12
公　AB	0	1	0	0	0	0	0
BB	87	11	1	34	65	0	0
AA	0	0	0	0	0	20	10
母　AB	0	3	0	0	0	0	2
BB	91	44	75	70	119	0	0
－－－－－－－－－－　ＰＧＤ遺傳型分析　－－－－－－－－
AA	88 (49％)	59 (100％)	76 (100％)	107 (100％)	196 (100％)	0 (0％)	0 (0％)
小計AB	78 (44％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)
BB	12 (7％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	36 (100％)	24 (100％)
AA	43	12	1	34	65	0	0
公　AB	37	0	0	0	0	0	0
BB	7	0	0	0	0	16	12
AA	45	47	75	70	119	0	0
母　AB	41	0	0	0	0	0	0
BB	5	0	0	0	0	20	12

表３．保種家禽ＰＨＩ和ＰＧＤ遺傳型鑑別統計表

保種動物	土　雞	褐色菜鴨	黑色番鴨	灰色中國鵝	白色中國鵝
採血連絡人	葉素惠	康清亮	康清亮	邱作相	邱作相
血樣鑑定人	葉素惠	康清亮	康清亮	葉素惠	葉素惠
保種地點	新化總所中興大學	宜蘭分所	宜蘭分所	彰化場	彰化場
已完成隻數	1152	182	94	95	107
公	272	67	40	28	30
母	879	115	54	67	77
系譜不全	0	0	0	0	0
－－－－－－－－－　ＰＨＩ遺傳型分析－－－－－－－－
AA	1151 (100％)	142 (78％)	94 (100％)	95 (100％)	107 (100％)
小計　AB	0 (0％)	40 (22％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)
BB	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)
AA	272	50	40	28	30
公　AB	0	17	0	0	0
BB	0	0	0	0	0
AA	879	92	54	67	77
母　AB	0	23	0	0	0
BB	0	0	0	0	0
－－－－－－－－－　ＰＧＤ遺傳型分析　－－－－－－－－
AA	1151 (100％)	182 (78％)	94 (100％)	95 (100％)	107 (100％)
小計　AB	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)
BB	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)	0 (0％)
AA	272	67	40	28	30
公　AB	0	0	0	0	0
BB	0	0	0	0	0
AA	879	115	54	67	77
母　AB	0	0	0	0	0
BB	0	0	0	0	0

圖1. 各種家畜品種的 PGD（上圖）和 PHI（下圖）電泳（pH=8.7）後之位置比較。注意其和血紅素之相對位置。

圖2. 各種家禽品種的 PGD（上圖）和 PHI（下圖）電泳（pH=9.0）後之位置比較。注意其和血紅素之相對位置。

褐色菜鴨萃取粒線體 DNA 後，以 Hind 丙型作用均切成 4 個片段，若以 Pst 甲型亦切成 4 個片段，但以 Bgl 乙型，Pvu 乙型，BamH 甲型及 EcoR 甲型等酵素則無分切點。經 Hind 丙型酵素分切後的桃園豬、台灣水牛、台灣黑山羊、巴貝多黑肚綿羊、紐西蘭兔和雷克斯兔之粒線體去氧核糖核酸分別呈現四、三、二、一、七和七個片段型。從採樣到以Hind丙型酵素消化所得的片段型鑑別過程，合計約需十五小時。水牛、山羊、綿羊和兔的粒線體去氧核糖核酸分別有16.8、16.4、16.4 和17.2 仟核憇酸配對單位大小，此乃以豬的粒線體去氧核糖核酸（16.35 仟核憇酸配對單位）為對照時所估計之。上述所列的品種之粒線體去氧核糖核酸在EcoR 戊型酵素分切下，均呈現一個分切點。應用 Bgl 乙型酵素分切台灣水牛時，並無分切點，但對台灣黑山羊則有 3 個分切點（劉與吳，1993；駱與吳，1993）。台灣有的豬種，經以 Bgl 乙型酵素來分切各品種的粒線體去氧核糖核酸時，桃園種和約克夏種有一分切點，而蘭嶼種有兩個分切點，以及呈現三個分切點的藍瑞斯、杜洛克和漢布夏品種（薛等，1993）。因此，應用粒線體去氧核糖核酸片段多態型於本土品種家畜禽種原鑑別上，將利於確認母性遺傳根源。

六、結論與建議：

　　多數保種族群在 PHI 及 PGD 分析之變異性不大（Yeh et al.，1993 ；宋等，1993）。粒線體 DNA 也未發現有個體差異。挑選符合品種特徵和具繁殖子代資料的種畜禽，進行細胞核內的 DNA 萃取，保存種公、母畜禽細胞核內 DNA，並可進行DNA 指紋分析（陳與黃，1993；蕭與黃，1993）。即使保種族群消失，仍保有其遺傳資訊，供日後研究之用。並觀察保種家畜禽中有異於族群特徵之個體，保存其DNA和進行遺傳歧異度分析，以瞭解其遺傳組成是否異於同一族群中其它具有品種特徵之個體。但若能針對國外進口的冷凍精液亦進行 PHI 遺傳型鑑定（楊與吳，199）和開始瞭解 PHI 對偶基因的其他作用，將有助於增加種畜禽繁殖優勢（薛等，1994）。

七、參考文獻：

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Yeh, S. H., F. F. Huang, J. J. Liu-Tai and H. L. Chang. 1993. The　polymorphism of PHI, PGD and Hb in the native breed of domestic　animals. 中畜會誌 22(增刊)：138。